苎麻UDPGDH原核表达载体的构建与表达

通过RT-PCR 获得UDPGDH cDNA序列,经酶切、连接,以pET-32a为原核表达载体,构建成pET-32a- UDPGDH 重组表达载体.经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化表达受体菌E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后表达出1个约53 000的蛋白,与推测的UDPGDH编码产物的大小一致.凝胶成像分析表明,最高表达量可占菌体总蛋白的47.1%,表明UDPGDH 重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达.     

苎麻木质素合成酶CAD基因的cDNA克隆及表达分析

采用PCR结合RACE技术克隆苎麻栽培种湘苎3号CAD基因全长cDNA序列;再运用qRT–PCR技术对木质素含量不同的代表性苎麻品种湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻的CAD基因在其茎秆韧皮部和木质部的表达进行定量分析;使用1%间苯三酚和25%盐酸对4种苎麻茎横切片进行特异染色,观察品种间木质素染色度。结果表明,获得的苎麻CAD基因cDNA序列全长为1 378 bp(GenBank登录号,KF758396),编码359个氨基酸,推导为苎麻肉桂醇脱氢酶(BnCAD)。该推导蛋白质与已报道的几种植物木质素合成酶CAD的同源性均达90%以上,其中与蒺藜苜蓿的同源性达97%。运用qRT–PCR方法对BnCAD基因表达的定量分析结果显示,苎麻CAD基因在湘苎1号和湘苎3号的韧皮部表达水平明显高于其在木质部的表达水平,而在城步青麻木质部的表达水平高于其在韧皮部的表达水平,该基因在湘潭大叶白的韧皮部和木质部表达量接近。4种苎麻茎横切片的木质素染色结果表明,品种间木质素染色度与CAD基因在其韧皮部的表达量成正相关。     

苎麻镉响应基因BnG6 PDH1的克隆和表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖代谢途径的关键限速酶,为探讨G6PDH基因在苎麻耐镉机制中的作用,本研究在苎麻镉胁迫转录组的基础上,采用RACE方法从苎麻(Boehmeria nivea L.)品种中苎一号中克隆到BnG6PDH1基因(GenBank登录号为MG941010)的全长cDNA序列,该基因开放读码框为1 554 bp,编码517个氨基酸,蛋白质分子量为59 250,等电点为5.92。BnG6PDH1编码的氨基酸与川桑(XP_010111634.1)、枣(XP_015878928.1)、甜樱桃(XP_021825040.1)、苹果(XP_008362117.1)和梅(XP_008231184.1)的胞质型G6PDH蛋白的相似性较高,相似度分别为92%、91%、89%、88%和88%。组织表达特异性分析结果表明,BnG6PDH1在苎麻叶中的表达量最高,其次为茎,根部的表达量最低。镉胁迫诱导表达分析结果表明,BnG6PDH1的显著表达受镉的诱导,表达量随着镉质量浓度的增加而增加。以上结果表明,BnMYB1是一个镉应答基因,可能在植物对镉胁迫的适应中发挥重要作用。     

黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RT-PCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)。该片段长度为1 207 bp,包含一个936 bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271 bp的Poly A 3′非翻译区末端,无内含子;该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶、根、茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫相关。     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

[目的]研究蜡梅花香基因SAMT cDNA的克隆及表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMT cDNA的ORF片段,其长度为1 196 bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%。将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中获得重组菌种命名为PGSAMT,用0.01 mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66 kDa,与预期的26 kDa的GST带和42.3 kDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达蜡梅花香基因SAMT。     

大豆铁结合蛋白基因cDNA的克隆、序列分析和表达载体的构建

根据已报道的植物铁结合蛋白基因的保守序列设计引物，用RT－PCR方法，成功地从大豆总RNA中扩增出一大小为0.771kb的cDNA片断。将该片段克隆到pUCm-T载体上，测序和序列的同源怀分析表明该片断与Proudhon等（1996）报道的大豆铁结合蛋白基因的氨基酸序列同源性达95％。利用pUCm-T和pBI121载体上共同的XbaI和SacI双酶切位点，构建了克隆片段的植物表达载体pSFKna。该载体含CaMV35S启动子、NOS终止子和NPT－Ⅱ基因，在遗传转化中可用基因枪导入受体，并通过卡那霉素抗性筛选转化子。     

牛BMP3基因cDNA克隆及组织表达谱分析

用RT-PCR的方法克隆了鲁西黄牛BMP3基因1 555 bp的eDNA序列,该序列包含1个1 428 bp的完整开放阅读框,编码476个氨基酸残基;通过对推导的牛BMP3蛋白进行生物信息学分析发现,牛BMP3蛋白的分子量为53 506.27 D,等电点为9.42,该蛋白前22个氨基酸残基为信号肽序列,而亚细胞定位分析发现,该成熟蛋白可能位于细胞外.通过与最新公布的牛基因组比对,发现牛BMP3基因位于牛基因组第6号染色体上,由3个外显子和2个内含子组成,牛BMP3基因cDNA序列与人、小鼠、大鼠和鸡BMP3基因cDNA序列的相似性分别达到84%,81%,81%,79%,是进化上保守的基因.在牛卵巢、肝、肌肉、小肠、脂肪、子宫、肾脏、心肌、肺、胰腺等组织中都检测到BMP3基因表达,表明牛BMP3基因是一个功能重要、进化保守的基因,具有广泛的组织表达谱.     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因cDNA的克隆及表达分析

根据已知鱼类抗菌肽hepcidin的同源性设计简并引物,利用同源克隆结合RACE法从黄鳝(Monopterus albus)肝脏中扩增得到了黄鳝hepcidin基因全长cDNA序列(GenBank accession number FJ436808).结果表明,黄鳝hepcidin基因cDNA全长712 bp,5′端非翻译区有133 bp,3′端非翻译区有306 bp,包含1个273 bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽.同源性分析表明,黄鳝hepcidin推测的氨基酸序列与其他鱼类报道的hepcidin具有较高的同源性,并具有8个半胱氨酸这一典型特征,是hepcidin家族的1个新成员.采用半定量PCR法对该基因在健康成体不同组织的转录本和脂多糖(LPS)对该基因表达的影响进行了分析.结果发现,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24 h后,各组织的hepcidin基因表达量都有明显升高.     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一.本研究克隆了七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析.结果表明:七彩神仙鱼Vasa基因cDNA序列共2 370 bp,其中5'UTR占123 bp,3'UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp.氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的同源性最高.半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号.qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达.在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低.在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量.繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反.本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考.     

苎麻BnNramp2基因的克隆与生物信息学分析

<正>重金属是主要的环境污染物之一,所有重金属对生物都有潜在的危害作用~[1-6]。天然抗性相关巨噬细胞蛋白家族 (Natural resistance-associated macrophage protein, NRAMP) 是一类广泛存在于微生物、植物、动物中的古老且高度保守的膜整合蛋白家族,参与大多数有机体的金属离子     

苎麻SSR反应体系的优化

[目的]优化苎麻SSR反应体系。[方法]以苎麻湘苎2号基因组DNA为模板,对其SSR反应体系中的部分影响因素进行探讨分析,并利用选定的7个苎麻品种基因组DNA为模板,对优化的SSR反应体系进行试验验证。[结果]在25μl SSR反应体系中,模板量为50 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.10 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U时,反应体系为最佳。利用该反应体系,对7个苎麻品种进行的SSR反应结果显示不同品种间DNA谱带多态性丰富,同时表明优化的反应体系重复性和稳定性良好。[结论]该研究结果为应用SSR技术进行苎麻种质资源的研究奠定良好的基础。     

苎麻ACC氧化酶基因（BnACO1）的克隆及表达

【目的】克隆苎麻中的一个ACO基因（BnACO1）,并对其进行生物信息学分析、表达分析、胁迫应答分析。【方法】通过RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆该基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白质序列进行分析。利用实时荧光定量PCR分析BnACO1在苎麻不同部位的表达量以及在ABA、干旱和高盐胁迫下的应答。【结果】BnACO1的cDNA序列全长为1 476 bp,其开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸多肽,预测其分子量和等电点分别为36.81 kD和4.95,基因登录号为JX878855。与无花果（AB307720）、香叶天竺葵（U19856）、柿树（AB073009）、梨（JN807390）、猕猴桃（HQ293208）的ACO基因核苷酸序列相似性分别为83%、81%、79%、79%和79%,氨基酸序列的相似性分别为87%、80%、80%、78%和83%。实时荧光定量PCR分析表明苎麻BnACO1在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根、茎中表达最低,且该基因受ABA、干旱和NaCl胁迫诱导表达。【结论】获得的BnACO1是ACO家族成员之一,参与ABA、干旱、NaCl胁迫应答,该基因可能在苎麻性别分化中起到一定作用并且在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时具有独特的表达模式。     

苎麻不同基因型钾营养特性的研究

苎麻不同基因型在钾吸收、累积、分配、利用等方面存在明显差异。苎麻不同基因型单株平均的干重变幅为１０．４０ｇ－３４．５８ｇ，钾含量变幅为１．６７０－２．６９０％，吸外量变幅为０．２５３ｇ－０．７４１ｇＫ，钾利用效率变幅为３７．１８－５９．８８ｇ（ＤＭ）／ｇＫ钾收获指数变幅为０．１７７－０．３３０。     

苎麻CCoAOMT基因全长cDNA克隆与序列分析

【目的】试图分离和克隆苎麻内源咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因。【方法】采用RACE技术克隆基因，对序列应用ClustaW 1.82软件进行在线分析，将苎麻mRNA序列、mRNA编码区序列以及氨基酸序列与已报道的其它植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树。【结果】获得了苎麻CCoAOMT cDNA全长序列(GenBank注册号：AY651026)；苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶是氧甲基转移酶类；苎麻CCoAOMT基因mRNA序列与已报道的其他植物的相应序列不能聚为一类，其差异明显大于其它植物间的差异。苎麻CCoAOMT基因mRNA编码区序列与玉米（Zea mays：ZMA242980、ZMA242981）的同源性高于其他植物。推导的苎麻CCoAOMT酶蛋白氨基酸序列与杨树（Populus balsamifera：AJ224894、AJ224896）、美洲山杨（Populus tremuloides：PTU27116）的同源性高于其他植物。【结论】苎麻CCoAOMT基因cDNA与其它植物的相应序列具有同源性。     

苎麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因的克隆及其转基因烟草特性

【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分别构建其超量表达载体,并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因,利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定,并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析;通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体,并在农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404的介导下,通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中,通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因在转基因T1植株中的相对表达水平,并测定植株叶片中的GS活性、株高、鲜重、可溶蛋白及总氮含量。【结果】首次从苎麻中克隆了一对GS2等位基因,命名为BnGS2-1和BnGS2-2,等位基因序列全长1 340 bp,含有一个1 293 bp的ORF区,编码430个氨基酸残基多肽;等位基因核苷酸序列在11个位点上存在差异,导致编码的多肽在195、382位点上的氨基酸残基存在替换现象（BnGS2-1为脯氨酸和天冬酰胺,BnGS2-2为苏氨酸和丝氨酸）;NCBI BLASTP分析表明苎麻BnGS2与Pisum sativum、Vigna radiata、Glycine max、Phaseolus vulgaris、Medicago truncatula具有很近的亲缘关系;构建了能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2的载体,并获得能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2转基因烟草植株;与野生型烟草植株相比,超量表达BnGS2等位基因（BnGS2-1和BnGS2-2）都能显著性提高转基因植株叶片GS活性、鲜重和可溶性蛋白的含量,株高和总氮含量也有增加,但没有达到显著性水平。另外,超量表达不同BnGS2等位基因（BnGS2-1和BnGS2-2）的转基因烟草植株,在株高、鲜重、叶片可溶性蛋白及总氮含量上并没有显著性差异。【结论】在烟草中分别超量表达来源苎麻的BnGS2等位基因（BnGS2-1或BnGS2-2）均能显著提高转基因植株的生物产量和氮利用效率,并且所克隆的2个等位基因BnGS2-1和BnGS2-2在功能上并无显著差异。     

植物生长调节剂对苎麻茎秆抗倒伏性的影响

 运用三因素五水平二次正交旋转组合设计，研究了赤霉素、烯效唑和抑芽敏对苎麻茎秆抗倒伏性及其抗倒指数的影响，建立了相应的数学模型：Y=87.10-9.03X1+8.30X2 -9.41X12-12.25X32。经模拟选优得出，当赤霉素取14.29 mg·kg-1，烯效唑取20.00 mg·kg-1，抑芽敏取357.00 mg·kg-1时，抗倒指数达最大值103.23 g·mm-1，这个方程可作为反馈试验及大面积推广应用的基础。     

苎麻NAD7基因的克隆与分析

线粒体中泛醌氧化还原酶的7亚基基因(NAD7)是与植物呼吸代谢和植物细胞质雄性不育相关的重要基因之一。本研究利用NAD7的保守序列设计引物,用RT-PCR方法克隆了苎麻(Boehmeria nivea)NAD7的cDNA片段,其长度为969 bp,编码322个氨基酸。序列比对表明该cDNA序列及预测的蛋白序列与拟南芥、油菜有98%的同源性。聚类分析表明苎麻NAD7基因的进化处在很古老的地位。为深入研究苎麻雄性不育的分子生物学机理提供依据。     

苎麻多胚苗遗传多样性的SRAP标记分析

为分析苎麻多胚苗的遗传多样性,以靖西青麻和中苎1号杂交收获F1代种子,从中筛选出 21对双胚苗、3株三胚苗和1株单胚苗,用SRAP标记对这些材料及其亲本进行遗传分析.结果表明:筛选出的24个引物组合共扩增出159个稳定的多态性条带,平均每个组合6.8个;48份材料中成对遗传相似系数为0.360～0.876,在遗传相似系...     

蔸龄对苎麻光周期钝感生理雌性系生长,成花及性别表现的效应

对光周期钝感生理雌性系ＮＧ１ １、２、３年生麻的观察结果表明：随蔸龄的增大，株高增加、叶片数增多；第１期花的雄花及总花序数也随之增加；二麻的总花序节数及雄花序节数大大高于头麻，不同年份的成花量及性别比有较大差异。蔸龄及温度对ＮＧ１的生长、成花及性型表现有重要作用。     

苎麻基因资源的光合作用及其与产量品质关系的研究

研究了来自全国主要苎麻产区的基因资源光合作用及其与产量品质的关系,结果表明:(1)显著影响苎麻田间净光合强度(Pn)的因素,头、二、三麻依次减少;其中胞间CO_2浓度、叶室CO_2浓度、气孔阻力和气孔导度对三季麻Pn均有显著影响,而蒸腾强度对头、二麻Pn,叶温对二、三麻Pn有显著影响。(2)经逐步回归分析,建立了各季麻Pn与其主要影响因素的多元回归方程,这些方程对Pn的回归拟合结果,头、二、三麻平均误差率分别为3.35%,1.46%和3.30%。(3)季内各基因型问Pn差异显著,季间Pn则三麻>二麻>头麻;Pn与原麻产量呈显著或极显著正相关;Pn与单纤维支数相关不显著。头、二、三麻Pn均较高的资源有:浏阳“鸡骨白”、邻水“牛皮麻”、邻水“红顶家麻”、“园青6号”等品种。