利用内标为基础的多重RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒

草莓斑驳病毒(SMoV)和草莓轻型黄边病毒(SMYEV)分布较广,危害较重。应用CTAB法提取草莓总RNA,以优质的草莓总RNA为模板,结合扩增内标的检测体系,建立了SMoV和SMYEV的多重RT-PCR检测体系,可以对草莓田间植株和试管苗进行快速稳定的病毒检测。     

草莓脱毒技术的研究及应用进展

草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物,因其在种苗繁育上长期采用营养繁殖致使病毒不断累积而导致草莓产量降低、品质变劣等退化现象,且一旦感染病毒便会代代相传.因此,培育和应用脱毒苗是改善草莓品质、提高产量的有效途径.最早进行草莓离体培育研究的是日本的下村等(1960),他们的研究表明,热处理茎尖分生组织和组培相结合的方法,排除草莓病毒效果好.70年代国外对此项技术的研究更加趋于完善.我国此项研究始于80年代,北京市林业果树研究所1985年建立国内第一个草莓脱毒试管苗生产基地.其间草莓的各种器官、组织和细胞的培养研究迅速发展起来.同时,北京农林科学院、中国农业科学院等开展利用草莓茎尖分生组织培养、花药培养、热处理等法进行草莓脱毒研究,直到90年代我国才开始先后有几家单位建立起产业化草莓脱毒研究及生产技术体系.本文从以下几方面综述草莓脱毒技术的研究及应用进展.     

草莓斑驳病毒的分子杂交检测

为探索分子杂交技术在草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)检测中的运用,利用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸,并以此为模板,利用特异引物扩增SMoV非编码区序列,经克隆、测序获得SMoV非编码区序列。系统进化分析结果显示:本研究中的分离物与GenBank中已报道的分离物的亲缘关系较远,独立形成1个小的进化支。以带有病毒特异片段的质粒为模板,运用PCR技术制备了地高辛标记的cDNA探针。以草莓感染SMoV叶片为试材,利用地高辛标记探针可有效检测草莓叶片中的SMoV,草莓总核酸样品稀释10倍后仍可有效检测。     

利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓皱缩病毒(SCV)和草莓镶脉病毒(SVBV)

[目的]通过对反应条件和参数的摸索与优化,建立多重RT-PCR检测方法,实现2种病毒的同时高效快速检测。[方法]通过CTAB法与试剂盒提取RNA,以优质的总RNA为模板,进行梯度PCR,结合扩增内标的检测体系,建立多重RT-PCR检测方法。[结果]建立了优化的SCV和SVBV的多重RT-PCR检测体系,可以对草莓田间植株进行快速稳定的病毒检测。[结论]该研究为草莓病毒检测提供一种方便、高效的分子生物学方法,为草莓无病毒苗的实际生产提供技术支撑。     

甘薯羽状斑驳病毒RT-PCR检测

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列设计并合成特异性引物,建立SPFMV的RT-PCR检测程序。特异性和重复性实验结果表明,该方法能够检测SPFMV,具有很好的特异性和重复性。并对PCR产物进行测序鉴定,结果与报道的序列同源性为88.3%和98.6%,证实所扩增的片段是病毒基因的部分片段。     

草莓斑驳病毒分子变异及PCR检测技术研究

【目的】明确草莓斑驳病毒（Strawberry mottle virus,SMoV）的分子变异特点;探索利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV的方法。【方法】利用RT-PCR扩增SMoV 3′非编码区（non-coding region,NCR）和大外壳蛋白（large coat protein,LCP）基因特异片段,并对扩增产物进行克隆测序。利用生物信息学软件分析不同地区分离物变异特点及系统发育关系。参考测序结果,在SMoV基因组保守区设计引物,利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV。【结果】获得了SMoV中国分离物的NCR区和部分LCP 基因核酸序列,不同分离物部分LCP基因核酸序列同源性为76.8%～99.7%。系统进化分析显示不同分离物呈现轻微的地理相关性。3个波兰分离物,4个中国分离物中的3个,7个荷兰分离物中的4个分别聚集成一簇;2个德国分离物与其它分离物亲缘关系较远,形成一个独立的分支。建立了利用半嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV的技术体系,灵敏度高于常规PCR。【结论】SMoV不同分离物变异复杂,德国分离物可能是一个代表特殊株系的群体;基于定位基因组保守区引物,利用嵌套PCR和转录增强技术可有效检测SMoV。     

草莓脱病毒技术基本知识(一)

大量使用脱病毒苗将成为21世纪我国果业发展的重要方向.当前,我国脱病毒苗的繁育工作已取得一些成功进展.如脱病毒草莓已运用于生产实际中,取得了良好的经济效益.     

安徽草莓退化及病毒问题研究

分析了安徽草莓生产现状及病毒退化问题，针对这些问题提出了解决途径和方法，以促进安徽草莓种植业的持续、高效发展。     

福建省香石竹斑驳病毒的鉴定及其脱除

１９９５－１９９８年调查了福建香石竹主要种植地的病毒病，经症状观察，生物学鉴定，电镜观察和间接ＥＬＩＳＡ法检测，明确了香石竹斑驳病毒是福建省田间流行的主要病毒种类，带毒率为３０．８％－７２．４％，脱毒技术的研究结果表明，热处理，茎尖培养脱毒效果均不够理想，而茎尖培养加药物处理，在培养基中加病毒必克２ｍｌ．Ｌ＾－１，５ｍｌ．Ｌ＾－１，１０ｍｌ．Ｌ＾－１，ＣａｗＭＶ脱除率分别达３５．７％，４６．７％，     

草莓根尖脱毒组培及无病毒苗繁育技术研究

针对传统的草莓茎尖脱毒组培技术所存在的操作繁琐、效率低、消毒难彻底、组培苗污染率高等问题,课题组根据多年试验研究成果,提出了一种操作简便、效率高、消毒易彻底、组培苗污染率低、繁殖速度快,苗质好的草莓根尖脱病毒组培及其病毒快速检测技术,摸索出一套草莓根尖脱病毒组培快繁及规模化生产技术。     

菜豆荚斑驳病毒免疫捕获一步RT-PCR检测

【研究目的】建立快速、准确、简便的检测大豆种子上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获一步RT-PCR方法(一步IC-RT-PCR)。【方法】采用抗原捕获和一步RT-PCR相结合的方法,并通过反应条件优化,确定一步IC-RT-PCR的反应程序,同时对该方法的特异性及实际检测效果进行验证。【结果】成功建立了一步IC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒方法,能够从感染菜豆荚斑驳病毒的大豆种子上扩增出预期大小的特异性片段,而对其他病毒及健康大豆无特异性反应;应用该方法对不同产地大豆种子样品进行检测,结果从来自美国的大豆样品中检出菜豆荚斑驳病毒,检出率为50%。【结论】一步IC-RT-PCR方法可以快速、准确地检测大豆种子上的菜豆荚斑驳病毒,适用于口岸检验检疫。     

利用可视化蛋白芯片快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是瓜类作物上重要的病原病,需建立快捷、准确的检测方法.以硝酸纤维素膜为固相载体,采用ELISA双抗夹心法建立了对CGMMV的可视化蛋白芯片检测方法,并对捕获抗体稀释倍数、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色温度等进行优化.结果表明,最佳检测条件为:捕获抗体稀释倍数1∶5,样品20℃孵育1h,酶标抗体20℃孵育1h,20℃15min显色.以50批葫芦科种子为样品,对可视化蛋白芯片检测与DAS-ELISA检测进行了比较,其检测结果吻合率达98.0%;经PCR检验,检测结果一致性良好.说明该方法能对植物病毒做出快速、准确的检测.     

泰国进口玉米种子玉米褪绿斑驳病毒的检测

采用DAS-ELISA对从泰国进口的6个玉米品种的种子进行玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)检测,结果显示其中1个样品为MCMV阳性,其他品种为阴性。RT-PCR检测结果进一步证实该样品为阳性。对PCR产物进行测序,将分离物序列与已发布的23条MCMV序列进行比对和系统进化分析,结果表明该分离物的序列与中国分离物和泰国分离物的遗传距离较近,同分化在进化树的同一个簇。取5号样品的100粒种子进行DAS-ELISA检测,结果仅有2粒种子为阳性,即MCMV的检出率为2%。     

草莓叶片不同保存方法对RT-PCR检测 草莓斑驳病毒效果的影响

植物样本保存方法不当易导致样本枯萎和腐烂，严重影响病毒检测结果。为提高PCR法检测草莓斑驳病毒（strawberry mottle virus，SMoV）的效果，明确待检测植物样本的有效保存条件，将经过RT-PCR检测感染SMoV的草莓叶片作为试验材料，设置自然风干保存、硅胶干燥保存和氧化钙（CaO）干燥保存3种不同的干燥保存条件。采用试剂盒法提取各处理草莓叶片总RNA，设计特异性引物进行RT-PCR检测。比较得到最佳干燥保存条件后，再以几种常见的低温、干燥保存为对照，分析草莓叶片不同保存方法对草莓斑驳病毒PCR检测效果的影响。电泳结果显示，含有SMoV的草莓叶片在CaO干燥保存条件下PCR检测效果最好，且操作简单易行。该方法可以为高效、便捷的保存带毒草莓叶片样本提供参考，适用于田间大量样品的采集，提高检测效率。     

贵州辣椒脉斑驳病毒的检测及株系分化研究

[目的]明确贵州辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)的分布和遗传进化情况,为该病毒的基因功能及其与宿主植物互作关系研究提供科学依据.[方法]采用反转录PCR(RT-PCR)对采自贵州贵阳、遵义、黔西和大方的疑似ChiVMV辣椒样品进行扩增并测序;运用DNAMAN和MEGA对ChiVMV CP基因和和3'-UTR进行序列拼接及分析,并构建系统发育进化树.[结果]从39份疑似ChiVMV辣椒样品中检测出7份阳性样品,检出率为17.95%.将贵州ChiVMV株系的部分CP基因和3'-UTR序列在NCBI中进行核苷酸序列比对,发现其与来源于四川辣椒上的ChiVMV株系的同源性最高,为99%,与我国其他省份ChiVMV株系同源性大于90%;构建的系统发育进化树表明贵州株系与四川和云南株系亲缘关系最近.[结论]贵州ChiVMV株系存在明显的株系分化现象.     

结合内标的RT-PCR技术检测草莓轻型黄边病毒(SMYEV)

草莓(Fragaria ananassaDuch)是蔷薇科(Ro-saceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物.在长期的生产过程中,草莓同其他无性繁殖植物一样,易感染病毒,从而造成草莓品种的种性退化.     

云南鬼针草上发现鬼针草斑驳病毒

 【目的】鉴定侵染鬼针草引起花叶或斑驳的病原。【方法】利用电镜技术观测病原粒子;间接ELISA方法鉴定病原与马铃薯Y病毒属病毒的血清学关系;分子生物学技术克隆了病原3′-端序列;BLAST,Clustal_X,BioEdit和MEGA 4.0等生物信息学软件用于所得序列的序列分析。【结果】在电镜下可观察到长约650-700 nm×13 nm左右的线状病毒粒子和风轮状内含体;利用Potyvirus PathoScren试剂盒检测呈阳性;用马铃薯Y病毒科病毒简并引物可扩增获得一条约1 800 bp的片段;序列分析表明该序列与鬼针草斑驳病毒相应序列高度相似,外壳蛋白的氨基酸同源性及3′-UTR核苷酸同源性均达96%以上。【结论】侵染云南鬼针草引起花叶或斑驳症状的病原为鬼针草斑驳病毒,这是该病毒侵染中国鬼针草属植物的首次报道。     

TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.     

香石竹斑驳病毒(CarMV)的研究进展

香石竹斑驳病毒(CarMV)是侵染香石竹的主要病毒之一,严重影响香石竹切花产量与品质,影响其经济价值和进出口贸易。目前对香石竹斑驳病毒已有大量研究,为系统了解该病毒,笔者从CarMV的病原学、血清学和分子生物学,CarMV病害发生与检测及CarMV防治方法等方面综述了CarMV的研究现状。