新一代测序技术及其对水稻分子设计育种的影响

本文概述了以边合成（或连接）边测序为特征的新一代测序技术的基本原理以及现有的Roche（454）GSFLXsequencer、Illumina genome analyzer（Solexa）、Applied Biosystems SOLiDsequencer、HeliScope Sequencer等4种新一代测序平台的发展历史、测序流程、优缺点和测序成本等,并展望了新技术的发展可能对以水稻为代表的农作物大规模分子设计育种产生的影响。本文还提出通过对水稻核心种质育种材料体系的全基因组测序,开发功能性分子标记和特异基因芯片,缩短将基础研究成果应用于实际育种生产的时间,为真正进入分子设计育种时代奠定基础。     

我国黄瓜基因组研究取得重大突破

由国科学家发起和主导的国际黄瓜基因组计划研究取得重大突破,通过采用新一代测序技术,自主开发了一套全新序列拼接软件,成功的以较低成本绘制出了黄瓜基因组精细图,并在《自然遗传学》（Nature Genetics）杂志上发表了世界第一个蔬菜作物基因组测序和分析的重要论文。     

基于高通量测序技术的转基因玉米GM11061分子特征研究

鉴定外源DNA片段在受体基因组中的插入位点、整合序列与拷贝数信息是转基因植物安全评价体系的关键环节。传统的转基因植物分子特征鉴定技术繁杂费力、耗时低效且具有一定的局限性。本研究利用基因组重测序技术与实验室自建的数据分析流程,针对转基因玉米GM11061开展了分子特征鉴定研究,结果表明:外源DNA片段仅插入受体基因组一个拷贝,位于5号染色体198,621,57～198,621,620 bp之间,不含载体骨架序列,并通过Sanger测序验证了其上下游结合位点。测序数据量梯度分析显示,最低～5×的重测序原始数据可实现该整合位点的鉴定。本研究证实Illumina高通量测序技术与配套的数据分析方法结合可实现简易、快速、精准的植物分子特征鉴定研究。本研究结果有助于植物功能基因组学基础研究,同时也为转基因安全评价体系的完善提供技术支撑。     

水稻26kDa球蛋白基因启动子克隆及序列分析

以水稻品种日本晴基因组总DNA为模板,采用PCR扩增获得约900bp大小的DNA片段,回收该片段并与pUCm-T载体连接,转化感受态大肠杆菌.进行PCR检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含904个核苷酸对;采用vector NTI软件将本试验中克隆的序列与Genbank（AY427575）公布的日本晴球蛋白基因启动子序列比对,有9个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻球蛋白基因启动子;在重要功能区段上,两者核苷酸序列完全一致.本研究认为造成长期不在一个环境中种植的同一水稻品种球蛋白基因启动子序列差异的原因之一,可能是核苷酸中性突变.水稻球蛋白基因启动子的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

5个水稻蛋白激酶的克隆、表达及活性研究

蛋白激酶在生长发育、表达调控、逆境反应、信号传导等几乎所有的生命过程中发挥着重要作用，蛋白激酶的研究具有重要的理论和应用价值。全基因组测序结果表明，水稻基因组中至少有1500个蛋白激酶。本研究利用已有的蛋白激酶序列，通过PCR扩增和重组克隆，将5个重要的蛋白激酶在酿酒酵母系统中进行了表达，它们的编号分别是：NM-189878，NM-194133，NM-190508，NM-197522和NM-197571，其中NM-194133具有较强的自我磷酸化活性。同源性分析表明，这些激酶在水稻中可能的作用包括：碳代谢的生物合成调控、种子形态发生、细胞分裂调控、生物和非生物刺激的反应调控等。这项工作为进一步的体外酶活分析及蛋白质－蛋白质相互作用研究等提供了基础，也为高通量克隆表达水稻蛋白激酶提供了一个有效的系统。     

基于SLAF-seq技术的树莓SNP位点开发

为分析树莓群体的遗传进化关系,开发特异性SNP标记。选用23 个栽培种树莓以用SLAF-seq技术测序,从树莓全基因组范围开发SNP位点,以黑树莓基因组为参考基因组,通过生物信息学分析进行电子酶切预测,筛选特异长度的DNA片断,构建SLAF-seq 文库。通过高通量测序的方式获得海量序列标签,利用软件分析比对,获得多态性SLAF标签,进而开发大量特异性SNP位点。对照水稻的测序数据与参考基因组比对结果,双端比对效率为95.60%,酶切效率为93.52%,说明SLAF建库正常。通过测序共产生59.93 Mb的读长数据,测序质量值Q30 平均为95.07%,所有样品GC含量均值为39.16%,GC含量普遍不高,说明达到测序要求。本研究共获得425402 个SLAF标签,其中多态性的SLAF标签共有121610 个。获得749811 个有效单核苷酸多态(SNP),利用这些SNP分析了23 个树莓种质的群体结构与系统发生树。利用简化基因组测序技术SLAF-seq 可以高效地、低成本地开发出大量的可用于群体遗传结构分析的SNP标记。     

国家科技计划支撑我国分子育种强力推进

植物功能基因组学研究成果显著。2001年公布了世界上第一张籼稻全基因组工作框架图，2002年12月完成了籼稻品种9311的全基因组“精细图”的测序，并预测出约6万个水稻基因，随后完成了粳稻（日本晴）4号染色体的精确测序，精确度为99．99％，覆盖染色体全长序列98％，是国际上最先完成精确测序的两条水稻染色体之一。目前我国已获得具有重要应用价值并拥有自主知识产权的抗病虫、抗逆、抗除草剂以及与产量、品质改良相关新基因400多个，取得了一系列具有原创性的研究成果。     

科学家加大对水稻品种的测序力度

国际水稻研究所（IRRI）启动了一项雄心勃勃的合作计划,从而在两年时间里对1万种水稻品种的基因组进行测序,这可能有助于培育更健壮、生长更快速或者产量比以前更高的新品种。     

牛源性无乳链球菌分离鉴定及 cfb 基因的克隆和真核表达载体的构建

为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗,采集隐性奶牛乳房炎奶样,利用THB （ Todd-Hewitt Broth ）固体选择培养基和色素试验,并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb,采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报道的链球菌cfb基因序列,经ORF分析和B细胞表位预测,利用Primer 5．0软件设计cfb因子富含B细胞表位区域引物,添加酶切位点和真核表达元件,以分离株无乳链球菌的基因组为模板,PCR扩增cfb基因并连接T载体克隆测序,经测序确定无误后,连接pcDNATM 3．1 V5-His A（ pcDNA-cfb）真核载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒进行酶切和测序鉴定。结果显示,从89份隐性奶牛乳房炎奶样中分离得到8株无乳链球菌,成功构建了真核表达载体（ pcDNA-cfb）。 THB和色素试验初步筛选,可以作为快速分离无乳链球菌的一种方法,利用Bcepred和Lasergene-Protean软件对分离得到的无乳链球菌cfb基因序列分析,在所克隆的cfb基因序列内有多个优势抗原表位,因此,有望作为无乳链球菌基因工程疫苗研制的抗原靶标基因序列,为进一步研究其基因工程疫苗提供基础条件。     

单细胞测序技术发展及其在作物研究中的应用

作物同一组织中的细胞往往被认为是具有相同状态的功能单位,传统的检测手段分析的是细胞群体的总体平均反应。而单细胞测序是在单个细胞水平对基因组或转录组进行测序分析的技术,通过对单个细胞的DNA或RNA进行测序,表明组织系统层面的功能是由异质性细胞构成的,在解决生物异质性和生物材料的低获取量等问题上具有独特优势,极大改变了人们对许多生物现象的理解。本综述概括了当前单细胞测序技术发展、测序原理、测序流程以及在作物研究中的应用,并对当前已经取得成果的应用领域进行了阐述,以期为作物单细胞测序的研究与应用提供参考。     

链霉菌及其代谢产物防治水稻稻瘟病的研究进展

稻瘟病是对水稻最具破坏性的疾病之一,研发出稻瘟病有效的生物防治剂,对实现水稻产业可持续发展具有重要意义。在过去的几十年里,已有一些微生物活体制剂及代谢产物在水稻生产过程中得到了应用,并取得了一定的成效,但还远远不能满足生产的需要。链霉菌作为一种重要的拮抗微生物,是人们挖掘抗稻瘟病生防制剂的重要资源。近些年来,人们已通过室内抑菌试验、温室盆栽和小区防效等方法挖掘出一些对稻瘟病有良好防效的链霉菌活体制剂和代谢产物,为开发新型的抗稻瘟病生物农药奠定了良好的基础。本文主要对链霉菌及其代谢产物在防治稻瘟病方面的研究进行综述,为开发新型的抗稻瘟病生物农药提供科学依据。     

主要麻类作物基因组学与遗传改良:现状与展望

随着测序技术的发展,主要麻类作物(黄麻、红麻、苎麻、亚麻和工业大麻)参考基因组从2011年至2020年陆续完成测序,这标志着麻类作物科学已经进入基因组时代。文章首先详细概述主要麻类作物基因组测序。其次,评述了基于基因组学的麻类作物重要应用价值基因挖掘。基于参考基因组和转录组测序,大量关于纤维发育、响应非生物胁迫的候选基因被挖掘,以促进麻类作物纤维的物种特性和“不与粮食争好地”的逆境农业。同时不同麻类作物特异性状候选基因陆续被报道,如红麻雄性不育、亚麻种子含油量和大麻大麻素相关候选基因等。再次,麻类作物基因组测序完成为基于组学的麻类作物遗传改良提供可能:有助于麻类作物种质资源形成和演化机制研究,系统解析纤维产量、纤维品质、抗病耐逆等农艺性状形成的分子基础;有助于建立高通量基因型-表型数据库,挖掘优异基因资源与创制新种质;有助于创新并集成分子标记辅助选择、基因组选择、转基因等技术,建立高效的快速育种技术体系。宜选育高产高效、抗逆抗病、适宜轻简化机械化、优质专用的多用途麻类作物新品种,以满足麻类作物相关产业的市场需求,适应麻类作物生产方式。尽管已经获得重要基因以及位点的信息,但如何高效率利用已有基因资源对麻类作物进行遗传改良仍需面临一系列挑战,如成熟稳定的遗传转化体系、麻类作物基因编辑体系构建及基因组选择育种等。     

长雄野生稻(Oryza longistaminata)全基因组Fosmid文库构建

长雄野生稻(O.longistaminata)起源于非洲,具有和亚洲栽培稻相同的AA基因组,是栽培稻改良的重要遗传资源。本研究构建了长雄野生稻全基因组fosmid文库,共获得33.6万克隆,文库的平均插入片段大小约为40kb,其中94.7%的克隆插入片段大小在30~50kb之间。挑取其中约11万克隆并保存,可覆盖10倍栽培稻基因组,对任意基因或序列的筛选概率达到了99.99%。将剩余的22万个克隆进行了末端配对测序,显示其有助于长雄野生稻全基因组测序的拼接。所构建的fosmid文库为筛选和克隆长雄野生稻的有利基因提供了研究材料。     

Comparative genomics of Brassicaceae crops

The family Brassicaceae is one of the major groups of the plant kingdom and comprises diverse species of great economic, agronomic and scientific importance, including the model plant Arabidopsis. The sequencing of the Arabidopsis genome has revolutionized our knowledge in the field of plant biology and provides a foundation in genomics and comparative biology. Genomic resources have been utilized in Brassica for diversity analyses, construction of genetic maps and identification of agronomic traits. In Brassicaceae, comparative sequence analysis across the species has been utilized to understand genome structure, evolution and the detection of conserved genomic segments. In this review, we focus on the progress made in genetic resource development, genome sequencing and comparative mapping in Brassica and related species. The utilization of genomic resources and next-generation sequencing approaches in improvement of Brassica crops is also discussed.     

水稻密穗突变体A989突变基因克隆和转基因植株分析

从水稻T-DNA插入突变群体中分离得到一个密穗突变体A989,表现晚开花、穗二级枝梗和小花数增加以及包颈。分子检测证明A989中T-DNA是单拷贝插入,通过inverse PCR的方法分离得到A989中T-DNA的旁邻序列,表明T-DNA插入在RCN2基因polyA加A位点后330bp处;RT-PCR检测发现在A989中,RCN2基因的表达被显著上调。利用2×35S启动子在野生型水稻Zhonghua 11中超表达RCN2基因,转基因植株表现为不抽穗,通过细胞学观察发现转基因植株能完成营养生长向生殖生长的转变,但是生殖生长期的分生组织在分化出二级枝梗原基后停止分化和生长。此外,通过比较部分开花相关基因在野生型Zhonghua 11、突变体A989中的表达,推测了RCN2基因可能的作用途径。     

棉花功能基因组研究进展

棉花是重要的经济作物。近年来棉花功能基因组研究发展迅速,高通量测序技术应用于棉花研究,二倍体和四倍体棉花基因组测序陆续完成,棉花全基因组重测序及关联分析相继涌现,大量的棉花功能基因被分离鉴定。本文回顾了棉花功能基因组研究的历程,重点介绍了棉花基因组测序和棉花栽培品种全基因组关联分析相关研究成果,并总结了棉花纤维和腺体发育中的关键功能基因及棉花抗旱、抗盐碱等功能基因研究进展,为全面了解棉花重要农艺性状形成的遗传基础和棉花遗传改良提供理论参考。     

Collection,preservation and distribution of Oryza genetic resources by the National Bioresource Project RICE (NBRP-RICE)

Biological resources are the basic infrastructure of bioscience research. Rice (Oryza sativa L.) is a good experimental model for research in cereal crops and monocots and includes important genetic materials used in breeding. The availability of genetic materials, including mutants, is important for rice research. In addition, Oryza species are attractive to researchers for both finding useful genes for breeding and for understanding the mechanism of genome evolution that enables wild plants to adapt to their own habitats. NBRP-RICE contributes to rice research by promoting the usage of genetic materials, especially wild Oryza accessions and mutant lines. Our activity includes collection, preservation and distribution of those materials and the provision of basic information on them, such as morphological and physiological traits and genomic information. In this review paper, we introduce the activities of NBRP-RICE and our database, Oryzabase, which facilitates the access to NBRP-RICE resources and their genomic sequences as well as the current situation of wild Oryza genome sequencing efforts by NBRP-RICE and other institutes.     

Gene Tagging by Activating DNA Transposon nDart in Indica Rice

As International Rice Genome sequencing Project (2005) demonstrated, the rice genome contains various transposons and about 13% of the genome is occupied by DNA transposons.     

水稻OsZ314基因克隆及转录激活验证

穗是水稻(Oryza sativa L.)重要的生殖器官,其生长发育直接影响水稻的产量和品质。前期研究中,我们对水稻生殖生长时期穗发育各阶段的转录组、蛋白组数据进行联合分析,筛选到一个MYB基因家族的转录因子OsZ314基因。生物学信息分析表明,该基因位于1号染色体上,拥有典型的R2R3-MYB型转录因子结构域,且在水稻幼穗时期表达量最高;亚细胞定位结果显示,OsZ314基因定位于细胞核中;转录激活试验表明,OsZ314基因具有转录激活功能。本研究为深入探索OsZ314基因在水稻穗发育时期的分子生物学功能奠定了良好的基础。