应用SCAR标记技术对苦丁茶炭疽病抗性进行早期鉴定的构想

讨论了苦丁茶冬青的经济价值及其抗炭疽病育种的必要性和紧迫性;论述了RAPD-SCAR和AFLP-SCAR双重分子标记对苦丁茶抗炭疽病育种的重要意义,以及对苦丁茶冬青炭疽病抗性基因成功进行SCAR标记所必须完成的主要研究内容和必需解决的关键问题;提出了研究方案,并对其可行性进行了分析;预测了此项研究工作的预期结果,并就RAPD-SCAR和AFLP-SCAR双重分子标记技术应用于苦丁茶冬青的抗炭疽病育种工作的创新意义进行了探讨。     

普通小麦抗条锈新种质——WT212的细胞遗传学分析及其抗性基因的RAPD标记

对普通小麦抗条锈新种质--WT212的细胞遗传学及其抗性基因的RAPD标记进行了研究。结 果表明,WT212所携带的抗源不同于1BL／1RS易位系为基础的"洛类"抗源,而是一种来自黑麦染色体组的抗条 锈新抗源,初步断定WT212是只涉及1对染色体的小麦-黑麦易位系;RAPD分析筛选出重复性强、在抗病亲本 和抗性基因池稳定出现的特异DNA片段2个,即引物S369的扩增片段和引物S1397的扩增片段,其长度分别约 为770和1400 bp。对引物S369扩增出的特异片段与目的基因的遗传连锁性进行了分析,结果表明,引物S369扩 增出的特异DNA片段与目的基因紧密连锁。     

番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记

 【目的】寻找与番茄抗叶霉病基因Cf6连锁的分子标记。【方法】 以番茄抗叶霉病和感叶霉病亲本组合（03036×03748）的F2分离群体为研究材料,采用BSA法和RAPD技术筛选与抗病基因连锁的分子标记。【结果】经F2单株分析,在后代群体中扩增出了两条长约500 bp的特异片段,该特异标记与叶霉病抗性基因Cf6紧密连锁,遗传距离为8.7 cm。测序结果显示,目标片段的大小分别为619 bp和559 bp,并将该标记转换为SCAR标记。【结论】SCAR标记,可用于番茄叶霉病抗性分子标记辅助育种。     

普通小麦抗条锈新种质—体克2号的抗性遗传分析

对普通小麦抗条锈新种质-体克2号进行了遗传学分析和RAPD标记研究。结果表明,体克2号对条中32号生理小种的的抗性是由1对显性基因控制的。RAPD分析筛选出重复性强、在抗病亲本和抗性基因池稳定出现的特异DNA片段2个,即引物S369的扩增片段和引物S1397的扩增片段,其长度分别约为770bp和1400bp。利用Mapmaker3．0对引物S369扩增出来的特异片段与目的基因的遗传连锁性进行分析,该多态性差异与目的基因的连锁距离为10．4cM。     

家蚕抗浓核病毒分子标记筛选及分析

在抗DNV的品种秋丰、高感品种华八35及其近等基因系BC6中,通过495个RAPD随机引物在各个品种的DNA混合物中进行PCR扩增,获得了一个与家蚕抗DNV基因相关的分子标记S366,对这个标记进行了克隆、测序,并且根据序列设计特异引物转换成SCAR标记,在多个敏感性和抗性品种中进行了验证,证明此分子标记真实可靠.通过生物信息学对测序片段进行分析,发现该片段序列与黄嘌呤脱氢酶基因有91%的同源性.     

小麦抗条锈基因聚合及抗条中32号基因分子标记筛选

【目的】通过多基因聚合创制小麦抗条锈病新种质,并筛选小麦抗条中32号小种基因的RAPD标记。【方法】用分别抗条中32号、31号小种和水源14号小种的花育888-5、西农1376和212 3个育种材料进行杂交、复交,并花培纯合,对来自3个抗条锈育种材料的不同抗性基因进行聚合,建立DH系。用115条随机引物对该DH群体中抗条中32号小种基因进行RAPD标记分析。【结果】通过基因聚合,获得抗条中31号和32号小种的材料6个,占总材料的7.32%;抗条中31号和水源14号小种的材料6个,占总材料的7.32%;抗条中32号和水源14号小种的材料1个,占总材料的1.22%;未获得对3个供试小种均有抗性的DH材料。引物S20扩增出670 bp的多态性片段,该特异条带重复性强,S20可作为小麦抗条中32号小种基因的特异标记。【结论】创制了聚合2个抗条锈流行小种基因的抗条锈新种质13个。与抗条中32号小种基因紧密连锁的特异RAPD标记为S20。     

利用PCR技术同时检测番茄抗根结线虫基因(Mi-1)和抗叶霉病基因(Cf-9)

   利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗根结线虫的Mi-1基因和抗番茄叶霉病的Cf-9基因紧密连锁的CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合与Cf-9基因紧密连锁的CAPSl标记在抗病试材中可扩增出2775 bp的特异片段,且存在Taq I酶切位点,酶切后产生1177 bp、446 bp、370 bp和160 bp的不同特异片段;与Mi-1基因紧密连锁的CAPS2为共显性标记,抗性材料中产生915 bp的特异片段,Taq I酶切后产生719bp和196 bp的特异片段该体系可用于在同一PCR反应体系中对Mi-1和Cf-9 2个抗病基因进行同时筛选鉴定该体系的建立不仅省时、省工,节省费用,而且可用于苗期早期辅助选育,加快番茄育种进程     

与苦丁茶冬青雄性性状连锁的RAPD标记

通过正交试验设计对影响苦丁茶冬青RAPD-PCR反应的5种因素4水平进行优化试验,最终确定苦丁茶冬青RAPD—PCR的最佳反应体系为：在25μL反应体系中,DNA模板20ng,Mg2＋ 2．5mmol·L-1,引物浓度为0．3μmol·L-1,Taq聚合酶浓度为2．0U,dNTPs浓度为200μmol·L-1。最佳的RAPD-PCR扩增程序为：94℃预变性5min,然后94℃变性30s,36℃退火30s,72℃延伸120s,进行40个循环,最后72℃延伸10min;4℃保存。然后通过RAPD技术筛选了91条随机引物,共计有24条引物能在雌／雄DNA／样品池间显示多态性,其中引物S164和S191分别扩增得到2个雄性特异标记S164—900和S191—800。经多次重复实验,RAPD标记均能在雄性个体中稳定出现,故此标记可应用于苦丁茶冬青性别的早期鉴定。     

大白菜细胞质雄性不育特异RAPD标记的筛选

根据近等基因系分析原理,以大白菜细胞质雄性不育系CMS-2及其保持系B-2为材料.对大白菜细胞质雄性不育基因及其保持基因进行RAPD标记研究。引物S391在不育系中有特异性扩增,得到一条约700bp的特异片断;引物S425在保持系中有特异性扩增,得到一条约600bp的特异片,分别命名为S391-700bp、S425-600bp。采用Blastn进行核苷酸同源序列比较,结果发现S391-700bp存在一个开放阅读框架,这一开放阅读框架与植物叶绿体丝氨酸乙酰基转移酶DNA部分片段有很高的同源性;S425-600bp是新发现的一段DNA序列。根据测序结果设计特异引物,结果表明本研究所获得的两个标记片断都能确定其特异性。     

辣椒炭疽病基因紧密连锁的KASPar标记的开发

【目的】研究辣椒炭疽病抗性基因的遗传规律。在5号连锁群中,定位辣椒炭疽病抗性主效基因AnR_GO5,并开发分子标记。【方法】以高抗炭疽病品种PBC932(Capsicum chinense )为父本,以高感炭疽病的中早熟材料77013(Capsicum annuum)为母本杂交产生BC₄S₁、BC₄S₂群体,用于辣椒绿熟期抗炭疽病基因定位。选用尖孢炭疽菌为试验用菌,采用显微注射法对绿熟果接病,根据病斑直径进行表型分析。根据抗、感亲本重测序结果,开发与绿熟期抗炭疽病连锁的Kaspar标记。【结果】辣椒果实表面病斑直径呈连续分布,符合数量性状的遗传特点。通过连锁分析,将炭疽病抗性基因AnR_GO5定位在5号连锁群的标记P5L-866与标记P5L-259之间,遗传距离2.9 cM。开发的标记P5L-117 与基因紧密连锁,标记准确率93.5%。【结论】在辣椒的BC₃S₁群体中,将果实绿熟期抗性基因定位于5号染色体的标记区间内。辣椒炭疽病抗性遗传为显性遗传,是由两对主效基因控制的。     

苦瓜抗白粉病SCAR分子标记的开发

[目的]获得与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记,为加快苦瓜抗白粉病新品种的选育奠定基础.[方法]以高抗白粉病野生苦瓜MC18为父本、高感白粉病苦瓜栽培种MC1-2为母本创建F2代分离群体;经单株抗病性鉴定后,以BSA法构建F2代单株的高抗和高感白粉病苦瓜DNA近等基因池;利用SRAP技术筛选多态扩增片段,对仅在抗白粉病近等基因池和父本中出现的差异片段进行同收、测序、比对和转化成SCAR标记,并利用已知抗病性的单株DNA分析标记与苦瓜抗白粉病的相关性.[结果]从1188对SRAP引物组合中筛选到稳定阳性差异条带的引物组合5对,其中ME20EM5引物对扩增的差异条带长度为332bp,与葡萄抗体蛋白基因（抗性基因）的DNA序列有较高相似性,并将其成功转化成与苦瓜白粉病抗性相关、大小为320 bp的SCAR标记.[结论]开发的SCAR-ME20EM5分子标记可用于苦瓜抗白粉病分子标记辅助选择.     

甘蓝显性雄性不育基因CDMs399-3紧密连锁的分子标记

 【目的】筛选与甘蓝显性雄性不育基因CDMs399-3紧密连锁的分子标记。【方法】以甘蓝显性核不育为不育源转育获得的芥蓝BC4分离群体226个单株为试材,利用SRAP、SSR技术结合集群分析法筛选与CDMs399-3紧密连锁的分子标记。【结果】获得8个SRAP、1个SSR和1个SCAR标记与不育基因连锁,最近的双侧翼标记ENA14F-CoEm7R和8C0909,连锁距离分别为0.53和2.55 cM,并将侧翼标记ENA14F-CoEm7R转化为SCAR标记。【结论】本研究丰富了与CDMs399-3连锁的分子标记,获得多个紧密连锁的标记为该不育基因标记辅助转育和进一步精细定位奠定了良好的基础。     

小麦矮秆新基因的RAPD标记

以矮秆易位系山农31504-1和高秆种质系山农298为材料,利用BSA法对矮秆基因进行了RAPD标记。从300个十碱基随机引物中筛选出引物S152可在矮秆DNA池中扩增出特征带。利用100株F_2单株进行连锁分析表明,引物S152扩增的RAPD标记与矮秆基因连锁,遗传距离为10．73±3．31cM。该标记可用于分子标记辅助选择,并为矮秆基因的深入研究奠定基础。     

利用分子标记对无核抗病葡萄杂交后代的辅助选择

利用葡萄无核基因SCAR标记GSLP1-569,葡萄抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1354和抗霜霉病基因RAPD标记S416-1224,对欧洲葡萄无核品种×中国野生葡萄、无核品种自交共6个组合的127株胚挽救苗进行了无核、抗病的分子标记辅助选择。结果表明,在127株胚挽救苗中,检测出拥有无核基因SCAR标记GSLP1-569的杂种27株,其中4株杂种同时拥有无核基因SCAR标记GSLP1-569和抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1354;拥有抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1354的杂种28株,拥有抗霜霉病基因RAPD标记S416-1224的杂种19株,其中10株杂种同时拥有OPS03-1354和S416-1224。获得的无核、抗病葡萄杂种将为进一步选育出新品系奠定基础。     

生防真菌球毛壳ND35的RAPD特异序列的标记转换

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对包括球毛壳ND35在内的20个真菌分离物进行分析,筛选出球毛壳ND35的RAPD扩增特异性DNA片段,经pEASY—T3载体克隆和测序、Seqman整合后,用Primer5．0软件设计了球毛壳ND35的特异引物对CgND35—1：GTTGCCAGCCCGAGGGGAAG,CgND35—2：G111ACCAGCCATGCCTTGAAG,经优化PCR条件,成功获得球毛壳ND35的SCAR标记,该标记片段长度为329bp。用CgND35—1／CgND35—2引物对进行了SCAR标记特异性和灵敏度检测,表明该特异引物可用于球毛壳ND35的快速检测。     

桃果实非酸/酸性状分子标记的筛选

以桃品种‘京玉’、‘美味’的正反交F1代群体69株为试材,采用RAPD、AFLP技术与BSA相结合的方法筛选与桃果实非酸/酸性状连锁的分子标记。在筛选的301个RAPD引物中,只有引物S332在两基因池间产生的多态性片段与非酸性状连锁,但重组率高达28.9%。通过128对AFLP引物组合在两基因池间的分析结果表明,18对引物组合产生多态性。单株验证结果表明,只有3对引物组合E-ACT/M-CAT、E-TA/M-CTC和E-AT/M-CTA产生的多态性片段与果实非酸/酸性状连锁,连锁距离分别为16.2、1.47和2.99 cM。利用获得的连锁标记,构建D/d基因连锁群,连锁距离最近的2个标记AFTA-CTC、AFAT-CTA分别位于D/d基因位点两侧。     

Identification of Molecular Markers Linked to TuMV Resistant Gene in Cabbage

A total of 144 F2 individuals were obtained from the crossing between 1047 （susceptible） and A21 （resistant）. Two RAPD markers were screened out in 200 random primers using：BSA（Bulked Segregant Analysis）. Two RAPD markers, designated as AG13/2000 and U16/660, were 7.7 cM and 8.38 cM apart from the TuMVresistant gene, respectively. The two RAPD fragments were converted to SCAR markers. SCAR markers were confined in germplasm.     

Identification of Co-Segregating RAPD Marker Linked to Powdery Mildew Resistance Gene Pm 18 in Wheat

The Pm18 gene of wheat confers resistance to the powdery mildew which is oneof the most serious diseases in many regions of the world. In this study, bulked segregant analysis (BSA) was used to develop randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers linked to Pml8 gene. Three hundred and twenty decamer primers were screened and one of them was identified as RAPD marker (S411600) linked to Pml8. Using the F2 mapping population from the cross Pml8 × Chancellor, the marker S411600 was shown to co-segregate with the gene Pml8. This marker can be conveniently used for marker-assisted selection in wheat breeding programs for the identification or pyramiding of Pml8 with other resistance genes.