尼罗罗非鱼Dmrt1基冈克隆及在不同组织中的表达

Dmrt1基因是Dmrt基因家族的一个重要成员,在动物性别决定过程中发挥重要作用.参照小鼠Dmrt1基因DM保守区及有关文献,设计了1对简并引物,扩增了尼罗罗非鱼的Dmrt1基因,并对扩增产物进行了亚克隆与测序.结果在雌雄尼罗罗非鱼个体中各获得1个预期的基因片段.长度为140bp.序列无性别差异.序列同源性分析表明,尼罗罗非鱼Dmrt1基因DM盒区核苷酸序列与人和鼠相应基因的同源性为78%;编码的氨基酸序列与人和鼠相应基因编码序列的同源性为89%,充分显示了Dmrt1基因在进化上的高度保守性.进一步根据获得的Dmrt1序列,设计1对特异引物,采用RT-PCR技术对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究.结果发现,Dmrt1只在精巢中特异表达.在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达,提示该基因在性别分化和功能维持上可能具有重要作用.     

尼罗罗非鱼性别相关基因Dmrt1的RACE扩增和序列分析

[目的]为研究Dmrt基因的进化、尼罗罗非鱼性别决定机制和功能提供资料。[方法]以尼罗罗非鱼精巢cDNA为模板,采用简并PCR扩增和克隆其Dmrt保守区域,并采用3′RACE反应获得Dmrt1基因全序列。[结果]尼罗罗非鱼中Dmrt保守区域长度为158 bp。尼罗罗非鱼Dmrt1基因的DM-domain与奥利亚罗非鱼、虹鳟、青鱼将、新月鱼、人、小鼠中Dmrt1基因的DM-domain和尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼中DMO基因的DM-domain的核苷酸同源性分别为98.6%、87.9%、81.4%、82.1%、77.9%、77.1%、72.1%、72.1%,氨基酸同源性为100.0%9、7.8%、87.0%、87.0%、89.1%、89.1%、84.8%和84.8%。通过3′RACE反应,获得1 108 bpDmrt1的3′端序列。尼罗罗非鱼Dmrt1与奥利亚罗非鱼、虹鳟、青鱼将、新月鱼的氨基酸序列同源性分别为99.0%、62.0%、41.0%和73.0%。[结论]Dmrt1基因具有高度保守性。     

尼罗罗非鱼2个Dmrt基因的序列分析

参照不同物种DM结构域设计了一对兼并引物,扩增出一条带,长约150bp.对扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP分析筛选不同基因片段,进一步对筛选的不同基因进行了DNA测序.结果获得2个不同的Dmrt基因,采用BLAST方法与人类相应Dmrt基因进行序列比对,发现与人类相应Dmrt基因的氨基酸序列一致性分别为89.1%和100%.根据尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的拉丁文名,接习惯将其命名为onDmrt1,onDmrt2.与其他动物相关的Dmrt基因进行聚类分析,结果表明,不同进化地位动物的Dmrt基因DM域编码序列存在高度的同源性,显示Dmrt基因在系统进化上高度保守.序列上的相似性可能暗示着它们在功能上的保守性.     

Cloning and sequence analysis of DM domain of Dmrt gene in Guangxi Naja naja atra

[目的]了解广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域特性,为探讨眼镜蛇性别决定和分化发育的分子机制及证实Dmrt基因家族在爬行动物进化中的保守性提供理论依据.[方法]以广西眼镜蛇为材料,采用简并PCR扩增克隆眼镜蛇Dmrt基因DM结构域,并分析其与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄等相应Dmrt基因DM结构域的同源性及系统进化关系.[结果]克隆获得广西眼镜蛇Dmrt基因家族的两个成员,分别命名为Nn1 Dmrt和Nn2 Dmrt.经系统进化分析,发现两个Dmrt基因DM保守区核酸序列与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄相应Dmrt基因保守区核酸序列的相似性均在74％以上,其推导氨基酸序列的相似性均在80％以上.[结论]Dmr基因DM结构域编码序列在不同物种中同源性较高,Dmrt基因家族在动物系统进化上具有高度的保守性.     

广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域克隆及序列分析

[目的]了解广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域特性,为探讨眼镜蛇性别决定和分化发育的分子机制及证实Dmrt基因家族在爬行动物进化中的保守性提供理论依据.[方法]以广西眼镜蛇为材料,采用简并PCR扩增克隆眼镜蛇Dmrt基因DM结构域,并分析其与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄等相应Dmrt基因DM结构域的同源性及系统进化关系.[结果]克隆获得广西眼镜蛇Dmrt基因家族的两个成员,分别命名为Nn1 Dmrt和Nn2 Dmrt.经系统进化分析,发现两个Dmrt基因DM保守区核酸序列与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄相应Dmrt基因保守区核酸序列的相似性均在74%以上,其推导氨基酸序列的相似性均在80%以上.[结论]Dmr基因DM结构域编码序列在不同物种中同源性较高,Dmrt基因家族在动物系统进化上具有高度的保守性.     

尼奥罗非鱼及其亲本中性别分化相关基因的表达模式比较

Dmrt1、Amh、Cyp19a1a、Foxl2是鱼类性别决定与分化相关的重要基因,为了研究罗非鱼种间杂交后代的性别形成机制,对尼奥罗非鱼Oreochromis niloticus(尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus♀×奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus♂)及其亲本中这4个性别分化相关基因的性别表达模式进行了比较分析。结果表明:Dmrt1、Amh基因在尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼精巢中的表达量显著或极显著高于卵巢(P0.05或P0.01),而Cyp19a1a、Foxl2基因在卵巢中的表达量则显著高于精巢(P0.05),4个基因在尼奥罗非鱼精巢、卵巢中的表达模式与其亲本基本一致;奥利亚罗非鱼精巢中Dmrt1基因表达高于尼罗罗非鱼,卵巢中Cyp19a1a、Foxl2基因表达也高于尼罗罗非鱼;尼奥罗非鱼精巢、卵巢中4个基因的表达水平均低于其亲本,特别是精巢中Cyp19a1a、Foxl2基因的表达水平极低。推测Cyp19a1a表达抑制可能是引起尼奥罗非鱼雄性率高的重要条件之一。     

尼罗罗非鱼Sox基因PCR—SSCP分析

参照人SRY基因HMG—box保守区序列,设计1对兼并引物,采用PCR技术扩增了尼罗罗非鱼Sox基因,在雌、雄尼罗罗非鱼个体中均扩增出5条带,大小分别约为200、400、600、800、1200bp,回收200bp左右扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP分析,筛选不同基因片段。进一步对筛选的不同基因进行测序,结果获得了5个不同的228bpSox基因,与Gen-Bank联机．采用BLAST方法与人类相应SOX基因进行序列比对,发现其与人类相应SOX蛋白的氨基酸序列一致性分别为97．2％、97．2％、94．4％、96％、88．2％,显示出这些基因在分子进化上具有高度的保守性。     

尼罗罗非鱼Dmrt基因的序列分析

参照不同物种DM结构域设计了1对兼并引物,扩增出1条带,长约150 bp.对扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP 分析筛选不同基因片段,进一步对筛选的不同基因进行了 DNA 测序.结果获得2个不同的DmDmrt基因,采用 BLAST 方法与人类相应DmDmrt基因进行序列比对,发现其与人类相应的DmDmrt基因的氨基酸序列一致性分别为89.1% 和100.0%.根据尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的拉丁文名,按习惯将其命名为OnDmDmrt1和OnDmDmrt2.根据扩增出的DmDmrt1 DM-domain的序列设计上游引物,用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends) 法分离和测定了DmDmrt1 cDNA的3′序列,得到1 108 bp的片段,共编码262个氨基酸,与奥利亚罗非鱼、虹鳟、新月鱼、青鳉等动物的DmDmrt1的氨基酸序列进行比较,同源性分别为99%、62%、73%和41%.     

两个尼罗罗非鱼品系Hsp70基因序列比对分析

采用RT-PCR技术,对从美国和埃及引进的两个尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus品系(以下分别简称为美国尼罗和埃及尼罗)热休克蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)基因进行扩增并克隆测序。获得两个品系罗非鱼Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA序列,全长为1 923 bp,编码为640个氨基酸,含有Hsp70家族3个签名序列DLGTTYS、IFDLGGGTFD和VVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端保守序列EEVD,核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA。结合BLAST分析结果,可以确认,获得的cDNA序列为美国尼罗和埃及尼罗两个品系罗非鱼的完整编码序列。序列同源性分析表明,美国尼罗和埃及尼罗有3个氨基酸位点和12个核苷酸位点不同,美国尼罗Hsp70基因氨基酸序列与莫桑比克罗非鱼同源性最高为99.7%,而与家鼠同源性最低为83.6%。     

牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其 在睾丸组织中的表达水平

【目的】研究牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列和编码蛋白的结构,以及在睾丸组织中mRNA及其蛋白表达水平,探讨Dmrt7与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供依据。【方法】利用分子克隆技术获得牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的功能位点和二级结构等方面进行了预测和分析;通过半定量PCR技术检测Dmrt7基因mRNA在牦牛各组织器官中的表达水平;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA表达水平;并通过western blotting检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7蛋白的表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmrt7基因cDNA序列一致,包含一个长度为1 113 bp的开放阅读框,编码370个氨基酸,具有完整的DM功能域,二级结构主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主。在牦牛各组织器官中,Dmrt7基因mRNA仅在睾丸组织中特异性表达。牦牛睾丸组织中Dmrt7mRNA和蛋白的表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA和蛋白表达水平明显高于犏牛,且Dmrt7蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。     

金鱼Dmrt2基因表达分析

采用荧光定量PCR技术检测了Dmrt2基因的两个亚型Dmrt2a和Dmrt2b在金鱼(Carassius auratus)不同发育时期以及不同组织中的表达情况,用RACE技术克隆得到金鱼Dmrt2a cDNA序列的全长为1 755 bp,5’和3’非编码区长分别为188 bp和67 bp,推测的开放阅读框可编码499个氨基酸的多肽。分子系统进化分析表明金鱼Dmrt2a与其它鱼类Dmrt2a基因聚成一支,与斑马鱼(Daniorerio)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latipes)、罗非鱼(Oreochromis Niloticus)Dmrt2a的同源性分别为85%、61%、58%、58%。荧光定量PCR结果揭示,Dmrt2a在精巢中表达量最高,在卵巢中次之,而Dmrt2b在卵巢中表达量最高,在精巢中次之,二者在肾脏、消化道、肝脏、心脏和脑中都有表达,但表达量低;不同发育时期胚胎和仔鱼的Dmrt2a和Dmrt2b表达量变化很大,Dmrt2a在受精后24 h达到最高值,之后表达量降低,而Dmrt2b在孵化后仔鱼中表达量显著增加。     

家鸡2个Dmrt基因的序列分析

Dmrt基因编码的蛋白质是一个具DNA结合能力的转录调控因子,其DM结构域在不同进化类型的生物中具有相当的保守性.通过简并PCR克隆技术,扩增和克隆了家鸡基因组中的DM结构域,经序列分析,获得了两个具有不同DM序列的克隆,分别命名为GgDmrt2和GgDmrt5.联机与GenBank中不同进化地位动物的Dmrt基因进行聚类分析,结果显示,具有DM结构域的基因家族在两栖类、爬行类、鸟类中高度保守,并且存在着许多成员基因.     

牛Dmrt7基因的cDNA克隆及遗传变异

[目的]探讨牛Dmrt7基因的生物学功能及群体遗传变异情况,为进一步研究该基因对牛精液品质的影响奠定基础。[方法]以牛睾丸组织为材料,根据GenBank上发表的小鼠的Dmrt7基因序列设计并合成2对引物,通过RT—PCR分别进行了扩增并运用DNA-MAN软件及在线工具对所得到的序列进行了生物信息学分析;同时,以牛肾脏、肝脏、睾丸、肺、脾脏、瘤胃、子宫、小肠、心脏、卵巢和肌肉共11个组织为材料,另外设计2对引物用于组织表达谱分析。利用PCR—SSCP技术和DNA测序对Dmrt7基因的多态性进行检测。[结果]获得了一个长为1616bp的cDNA片段（GenBank登录号为EF534775）,该cDNA包含由1113个碱基组成的开放读码框（ORF）,该ORF编码370个氨基酸;发现在第四内含子上有一个C／G突变,随后在277头本地牛品种和国外牛品种中进行群体多态性检测,发现G等住基因频率分布范围从0～0．4138;基因杂合度,有效等位基因数和多态信息含量分别为0～0．4851、1．0000～1．9423和0～0．3675。[结论]克隆了牛Dmrt7基因的cDNA序列并进行组织表达谱分析,该G等位基因在本地牛品种和外国牛品种中没有差异。