我国允传染性支气管炎病毒地方分离株的形态观察和S1基因的RT—PCR扩增

参照了已表的ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株全基因组序列,自行设计合成了３和引物（ｙｏｕｌ＋、ｙｏｕ２－ｙｏｕＭ＋）,引物ｙｏｕ１＋和ｙｏｕ２－在Ｓ１基因两侧,跨幅约１６１０ｂｐ,引物ｙｏｕ２－和ｙｏｕＭ＋在Ｓ１基因的３’端,跨幅约５３０ｂｐ。用这两对引物对５个ＩＢＶ地方分离株（ＨＮ２,ＨＮ４,ＪＸ１,ＳＣ２和ＳＣ１）进行ＲＴ－ＰＣＲ,均成功地扩增出相应大小的目的片段。病毒在电镜下观察中以形态多变的冠状病毒粒子。     

传染性支气管炎病毒地方分离毒株S1基因的RT-PCR方法研究

以传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）标准毒株Ｍ４１为材料,根据Ｇｅｎｂａｎｋ公开序列自行全成一对特异引物,用于扩增ＩＢＶ的完整Ｓ１基因。建立了针对ＩＢＶ基因组ＲＮＡ特点的ＲＴ－ＰＣＲ方法。对反应体系中的重要反应物Ｍｇ＾２＋、ｄＮＴＰ和引物浓度进行优化,确定其浓度值分别为１．５ｍｍｏｌ／Ｌ,２００μｍｏｌ／Ｌ和４０μｍｏｌ／Ｌ。使用此反应体系对国内ＩＢＶ地方离毒株ＪＳ／９５／０３,ＳＤ／９７／０１等１０多     

鸡传染性支气管炎病毒地方-分离株S1基因克隆和基因型鉴定

利用ＩＢＶ全长Ｓ１基因特异性引物,以纯化的３个标准株Ｍ４１、Ｈ５２、Ｔ和６个地方分离株（ＱＤ、ＺＺ、ＧＺ、ＧＪ、ＤＬ和ＹＣ）的基因组ＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出预期大小约１．７３ｋｂｃＤＮＡ片段,经ＢＡＭＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切插入到质粒ｐＵＣ１８中,并在大肠杆菌ＪＭ８３中实现了克隆。对６个分离株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢＲＦＬＰ分析,表明ＱＤ、ＴＪ属于Ｍ４１基因型,ＺＺ和ＧＺ与Ｔ基因     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株

根据IBV Beaudette株全基因组序列，借助基因分析软件自行设计合成了3个引物（youl,you2-youM ),引物you1 和you2-在S1基因两则，跨幅为1611bp,引物you2-和youM 在S1基因的3‘端，跨幅为535bp，用引物you1 和you2-对5个IBV地方分离株（HN2、HN4、JX1、SC2和SC4）进行RT－PCR，均成功地扩增出预期大小的目的片段，对RT－PCR的产物用限制性内切酶PstI进行酶切分析，结果酶切产物中得到2条条带，大小分别为560和1050bp，与GeneBank中11株已发表的S1基因分析结果一致，初步鉴定结果显示，已经成功分离得到了IBV－S1基因。     

传染性支气管炎病毒上海分离株S1基因克隆及遗传变异分析

对4株最新鸡传染性支气管炎病毒上海分离株的S1基因进行RT-PCR法扩增、克隆和序列测定分析。结果表明所克隆的S1基因全长约为1.63 kb,与常用IBV疫苗株和其它血清型代表株的S1基因序列及推导的氨基酸序列相比较,核苷酸序列同源性为77.4%～82.9%,氨基酸同源性为74.7%～82.6%,为研究上海地区IBV分子流行病学积累了资料。     

30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析

利用IBVS1基因特异性引物对30株IBV毒株进行RT-PCR扩增,产物经纯化后进行测序,并利用DNAstar MegAlign软件分析S1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。结果表明,广西分离株GXIB/02与Mass41、Conn、Ark、PA、Del、JMK、H52参考株的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均较低,与美国80年代分离的毒株MW34、hotle、cal15、AustT株的序列同源性也很低。这一结果与血清学试验结果相吻合,说明广西分离株GXIB/02与当今流行的标准株以及过去流行的毒株都不相同,是一个新的变异株,由此推断广西已有不同血清型IBV毒株存在,可能导致新的变异株流行。     

鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及序列分析

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了一对可扩增N基因片段的引物,并得到了预期的438 bp长的扩增产物;将目的条带纯化并回收以后,克隆到pMD18-T质粒载体中,对插入片段进行序列测定,并与已发表的IBV N基因序列进行了比较和分析,证明扩增产物是正确的,从而建立起了一种准确、实用的检测、鉴定IBV方法.     

30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株SJ基因的克隆及序列分析

利用IBV S1基因特异性引物对30株IBV毒株进行RT-PCR扩增,产物经纯化后进行测序,并利用ONAstar MegAlign软件分析S1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。结果表明,广西分离株GXIB／02与Mass41、Conn、Ark、PA、Del、JMK、H52参考株的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均较低,与美国80年代分离的毒株MW34、hotle、call5、AustT株的序列同源性也很低。这一结果与血清学试验结果相吻合,说明广西分离株GXIB／02与当今流行的标准株以及过去流行的毒株都不相同,是一个新的变异株,由此推断广西已有不同血清型IBV毒株存在,可能导致新的变异株流行。     

一株鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析

对从山西省分离到的1株IBV(IBVSX16)的膜蛋白基因片段进行序列测定及分析,结果发现,IBVSX16株膜蛋白基因含有一个长681 bp的ORF,编码226个氨基酸残基组成的多肽,与疫苗株H120和中国分离株LX4推导的氨基酸序列比对发现,存在基因突变现象,未发现缺失和插入现象,变异主要发生在2～17位.系统进化关系显示19株IBV毒株分属于5个群.IBVSX16株位于第II群,中国IBV分离毒株主要集中在第Ⅲ群和第Ⅳ群,具有较明显的地理区域性,可见IBV分离株在基因进化关系上形成了自己较为独立的进化群.     

鸡传染性支气管炎病毒河南分离株S1基因克隆及遗传变异分析

根据GenBank中已发表的传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因,设计并合成了1对引物,采用RT-PCR技术扩增鸡传染性支气管炎病毒河南分离株(HN0501)S1基因,并进行克隆和测序.结果表明,所克隆的片段大小为1739 bp,包含S1基因和部分S2基因,S蛋白切割识别位点序列为RRSRR.序列比较分析发现,IBV HN0501株S1基因与澳大利亚N1株、吉林JAAS株S1基因核苷酸同源性分别为99.6%,99.8%,氨基酸同源性均为99.3%,而与其它支气管炎病毒株核苷酸同源性为66.4%~85.2%.通过IBV S1基因系统进化分析,结果发现HN0501株与N1株、JAAS株的亲缘关系近,而与其它支气管炎病毒株的亲缘关系均较远.进一步证实IBVHN0501株为IBV肾型株.     

鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从江西省一以产蛋下降、呼吸道症状为特征的蛋鸡群中分离到一株病毒，经血凝试验、干扰NDV、鸡胚发育试验等，证实该分离毒株为鸡传染性支气管炎病毒。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

通过鸡胚接种盲传,从重庆某地疑似鸡肾型传染性支气管炎的发病鸡群中,分离到一株病毒,该病毒能导致鸡胚出现侏儒胚。用此病毒回归10日龄雏鸡,可使试验鸡出现典型的花斑肾。尿囊液毒穴36～48h雪经差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化,在电镜下能观察到典型的冠状病毒形态,病毒粒子直径为80～120nm,有囊膜、纤突。应用反转录-聚合酶链式反应穴RT-PCR雪技术扩增出了该病毒的特异性基因M和N,这从分子水平进一步证实引起鸡群死亡的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析

[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒澳大利亚T株部分基因序列的克隆与分析

澳大利亚T株（IBV-T）是鸡肾型传染性支气管炎病毒（IBV）主要代表毒株之一.目前,在相关生物数据库中IBV-基因序列极少.实验通过对GenBank中已有IBV基因序列比较,在IBV编码蛋白S、N、M和RdRp基因的高度同源区设计了四对引物,并通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）获得特异性扩增产物.克隆测序结果证明扩增产物确为IBV相应基因片段.所获序列同IBV其它类型相关基因序列比较结果显示,编码蛋白S、N、M和RdRp基因的同源性分别为80.51%～87.22%%,85.83%～91.25%,89.63%～91.01%和85.97%～92.37%.实验丰富了生物数据库中IBV-T基因序列.所设计的引物表现很好的扩增效率和特异性,对于IBV其它毒株的检测和鉴定有一定的借鉴作用.     

Mab-ELISA对IBV毒株定性检测方法

针对禽传染性支气管炎病毒（IBV）血清型众多、临床检测不易的难题，用我国自已研制的2株IBV单克隆体，通过多种方法的比较与鉴定，建立起活用于定性检测IBV的包被鼠源IBV单抗的Mab-ELISA方法，其操作程序是：包被鼠源IBV单抗－被检测病毒－鸡抗IBV高免血清－兔抗鸡IgG(AGP效价1：32）－羊抗兔IgG-HRP;用本方法对国内46个IBV分离株及NDV、AIV－H9N2、PPMV－I等的检测，表明其具有较好的特异性和敏感性。     

表达鸡传染性支气管病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒M41株的基因序列(GenBank:AY851295.1),设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增其S1基因,并将扩增产物克隆到杆状病毒转移质粒pFast-VSV-G-CMV中,获得重组质粒pFast-VSV-G-CMV-S1,进一步将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭载体Bacm id-CMV-S1,再利用脂质体转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Ac-V-S1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以转导哺乳动物细胞并表达S1蛋白.     

鸡传染性支气管炎腺胃型病毒的分离与鉴定

从郑州某鸡场的病鸡中分离到１株病毒,经人工接种易感染鸡,可在第６ｄ出现精神不振,拉稀,第８ｄ出现死亡;并可致死部分鸡胚及产生卷曲胚,在鸡胚中干扰鸡新城疫病毒Ｌａｓｏｔａ株的生长,但不能凝集鸡红细胞,经１％胰酶处理后能集鸡红细胞,在电镜下观察,可看到直径约１００－１６０ｎｍ,周围有疏松突起,排列成花冠状的病毒粒子。初步鉴定了分离株是鸡传染性支气管炎病毒。