水稻叶绿体ATP合成酶基因转录丰度受赤霉素诱导调节

 采用mRNA差异显示技术分离和鉴定了水稻受赤霉素诱导的差异表达基因。经50个引物组合差异显示，获得21个诱导表达差异的cDNA片段。经反向Northern初步筛选对其中5个阳性片段进行克隆及序列分析。其序列经国际联网BLAST查询表明编号为GA21C的为水稻叶绿体ATP合成酶基因片段。Southern杂交结果证实此基因为单拷贝。Northern杂交结果显示确受赤霉素诱导表达且在诱导16 h后达到高峰，表明赤霉素诱导水稻产生生理反应过程涉及叶绿体基因表达。     

一个丙环唑诱导的水稻基因cDNA片段的分离与分析

采用差异显示技术,以丙环唑作为诱导剂,对水稻幼苗进行筛选,得到一个化学诱导表达增强的差异片段。生物信息学分析表明,此片段可在水稻EST库中找到多个同源序列,其氨基酸序列与水稻、拟南芥等植物的GMPase基因高度同源,位于水稻第1染色体,是抗坏血酸合成途径中的关键酶。RT PCR实验表明此基因在丙环唑诱导后表达增强。     

水稻杂种超亲表达26S蛋白酶体亚基基因OsHL1的克隆

运用DDRT PCR分离获得水稻杂种一代超亲表达的cDNA片段。以此序列在日本晴cDNA全长数据库进行同源搜索,检索到一个功能未知的全长cDNA,有1690 bp,命名为OsHL1,进一步分析发现它位于3号染色体上R2393和MRG4548之间。序列分析表明,该基因与日本晴编码26S proteasome regulatory particle non ATPase subunit 5基因片段的序列同源性为97％。其中包含一个完整的开放阅读框(ORF),编码443个氨基酸,氨基酸序列同源性分析发现高度保守区。RT PCR显示OsHL1基因的表达受到ABA和MeJA处理下调。推测杂种的表现可能与26S蛋白酶体亚基参与的信号调控相关。     

外源诱导提高茶树新梢EGCG含量过程的相关基因分离

以福鼎大白茶为试验材料,用荧光标记的mRNA差异显示技术,研究外源诱导物ID1在诱导提高茶树新梢EGCG含量过程中基因转录水平的变化,分离相关基因片段。从诱导茶树芽叶及对照中分离出18个差异显示的cDNA片段,反向Northern杂交显示其中5个片段可能是来自差异表达基因的转录产物,其中编号DD2、DD9、DD12、DD16为诱导表达上调片段,编号DD3为诱导表达下调片段。将这5个片段克隆于pGEM T-Easy载体,酶切鉴定结果显示载体以及插入的特异片段。序列测定表明,DD12的cDNA片段出现未识别码。通过NCBI网站(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)作Blast序列同源性分析。结果表明,DD2的差异cDNA片段与烟草的硫氧还蛋白过氧化物酶的基因序列同源;DD3的差异cDNA片段,是茶树一个RAPD产物(AJ516005.1)的一段序列,功能未知;DD9的差异cDNA片段与拟南芥、莲子的NADH脱氢酶具有很高的同源性;DD16的差异cDNA片段未能找到与之同源的基因序列,可能为新基因。     

受GA3诱导的一个水稻伸长相关基因的初步鉴定

 采用mRNA 差异显示技术对受GA₃ 诱导的水稻伸长相关基因进行了分离和鉴定。经100 个引物组合差异显示,在获得21 个受GA₃ 诱导表达的cDNA 片段的基础上, 对其中的GA 15b 片段克隆进行了序列测定。其序列经国际联网BLAST 查询表明GA 15b 为伸展蛋白类似蛋白的候选基因片段。定量PCR 进一步确证GA 15b 受GA₃ 所诱导。Southern 杂交表明GA 15b 以多拷贝形式存在。     

橡胶树抗病相关基因HbNPR1的克隆及其表达分析

前期利用cDNA-AFLP技术分离获得了一个与橡胶树抗棒孢霉落叶病反应相关的差异表达基因片段EST-IAN-188,通过Blast比对分析发现,该基因片段与植物抗病相关NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性。将该片段与橡胶树基因组序列进行比对,设计引物进行PCR扩增,得到了一个橡胶树NPR1基因的cDNA和基因组序列,命名为HbNPR1基因。基因序列分析显示,该基因编码区全长(CDS)1 374 nt,含有两个外显子和一个内含子,编码457个氨基酸,蛋白分子量为51.0 ku,等电点5.82,具有BTB/POZ、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域。qRT-PCR定量分析发现,HbNPR1基因在橡胶叶片中的表达丰度最高,特别是古铜期叶片;多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)诱导下HbNPR1基因在抗病品种(IAN873)的表达丰度明显高于感病品种(PR107);另外,SA、MeJA、ET处理下均能诱导HbNPR1基因的表达,SA处理后的表达量丰度最高。本研究初步表明,HbNPR1基因可能参与橡胶树抗病信号途径的调控和寄主对病原菌侵染的防御反应。     

受稻瘟病菌诱导的水稻OsBTB基因的分子特征和功能初探

报道了1个从稻瘟病菌诱导的水稻近等基因系H7R/H7S中克隆的类GMPOZ基因--OsBTB,通过测序获其全长cDNA并分析了该基因的序列特征。根据水稻基因组序列数据库搜索,将OsBTB基因定位在水稻基因组第2染色体上。Northern和Western杂交结果表明,OsBTB基因在水稻近等基因系H7R/H7S中均受稻瘟病菌诱导表达,且在非亲和与亲和互作中表达差异明显。定量PCR结果表明该基因的表达模式与所选取的抗性及抗性相关基因的表达模式一致。综合结果提示该基因可能参与了稻瘟病菌诱导的抗性反应。     

乙烯利诱导橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建

为解析乙烯利刺激巴西橡胶树橡胶增产的分子机制,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)成功构建了乙烯利刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库。经蓝、白斑筛选,共得到了118个阳性克隆。菌落PCR分析结果表明,92%左右的阳性克隆含有大小200～500bp的插入片段。随机选取25个克隆进行了测序,并用基因检索工具(Genbank)对获得的EST进行了Blastx分析,结果表明,5个EST属于无任何序列线索的未知序列,6个属于未知功能的推测蛋白基因,2个属于未知功能的蛋白基因,3个与已知功能基因具有较高的同源性。应用半定量PCR技术,对编号203片段进行的表达分析结果表明,该片段为乙烯利诱导特异表达基因,在乙烯利处理后24h范围内随处理时间的增加而表达量增强,叶片中没有检测到该基因的表达。     

水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析

根据Thanatephorus cucumeris G蛋白β亚基序列（AY884129）设计引物,对水稻立枯丝核菌AG 1IA的 G蛋白β亚基基因进行了克隆。PCR结果得到1条约为1.9 kb的扩增片段,包含1个约1.7 kb的完整开放阅读框,编码366个氨基酸。同源性检索发现该序列与大量Ｇ蛋白β亚基基因明显同源,一致性介于57.34%~88.14%。根据其推导cDNA序列设计引物进行RT PCR分析,发现该基因在对数生长期表达量最高,提示水稻立枯丝核菌AG 1IA G蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。     

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

小麦TaUCH基因的克隆和特性分析

摘要：在以前的工作中,本课题组通过cDNA-AFLP得到了一个219bp的泛素羧基末端水解酶的片段,本文以该片段为基础,通过电子延伸、RACE和RT-PCR,得到了两个全长cDNA克隆,分别命名为TaUCH1和TaUCH2,这两条序列在编码区只有一个氨基酸的差异。保守结构域预测显示,TaUCH1和TaUCH2的中部和C末端各有一个C19肽酶结构域。将TaUCH及其在植物中同源蛋白进行对比发现,TaUCH与水稻中的同类蛋白相似性最高。Southern杂交显示,TaUCH在小麦中以多拷贝或基因家族形式存在。     

玉米苗期水分胁迫下相关基因差异表达研究

采用cDNA-AFLP技术对玉米幼苗在PEG胁迫和土壤干旱胁迫下的基因表达进行了研究分析,获得转录本衍生片段(TDFs)488条,经测序和同源比对获得42个cDNAs。同源性BLAST搜索结果表明:18个cDNAs的同源序列均为功能未知的玉米克隆,7个cDNAs序列与功能已知的玉米基因同源,5个TDFs序列与功能未知的水稻克隆同源,7个TDFs序列与功能已知的水稻基因同源,剩余的cDNAs序列分别与西红柿、高粱等同源。在获得的cDNAs片段中,既有与干旱胁迫相关的重要功能蛋白,也有一些重要的转录因子。     

小麦TaUCHs基因的克隆和特性分析

为研究小麦的耐盐机理,在以前的工作中,本课题组采用cDNA-AFLP技术获得一个219 bp的泛素羧基末端水解酶的片段,本研究以该片段为基础,通过电子延伸、RACE和RT-PCR,得到了两个全长cDNA克隆,分别命名为TaUCH1和TaUCH2,这两条序列在编码区只有一个氨基酸的差异。保守结构域预测显示,TaUCH1和TaUCH2的中部和C末端各有一个C19肽酶结构域。将TaUCHs及其在植物中的同源蛋白进行对比发现,TaUCHs与水稻中的同类蛋白相似性最高,有88%的同源性。Southern杂交显示,TaUCHs在小麦中以多拷贝或基因家族形式存在。以上结果说明TaUCHs是小麦中的羧基末端水解酶基因,可能参与了植物胁迫反应中某些受损伤蛋白或重要调控蛋白的降解。     

Effect of pre-emergence herbicides and timing of soil saturation on the control of six major rice weeds and their phytotoxic effects on rice seedlings

The study evaluated the effects of pre-emergence herbicides and their rates [oxadiazon (0.5 and 1 kg ai ha⁻¹), pendimethalin (1 and 2 kg ai ha⁻¹), and pretilachlor with safener (0.6 kg ai ha⁻¹)], and time of soil saturation establishment after herbicide application [1, 3, 5, and 7 days after spray (DAS)] in controlling the six major rice weeds, and their phytotoxic effects on rice seedling growth. All herbicides provided 100% control of Echinochloa colona, Echinochloa crus-galli, Leptochloa chinensis, Cyperus iria, and Amaranthus spinosus. Murdannia nudiflora was 100% controlled by oxadiazon and pretilachlor with safener, but poorly controlled (22–75%) by pendimethalin. Pendimethalin at 2 kg ai ha⁻¹ was more effective than at 1 kg ai ha⁻¹ in reducing the biomass of the stem, leaf, and root of M. nudiflora irrespective of timing of soil saturation. Rice plant height was reduced to a maximum (77–96%) by pendimethalin at 2.0 kg ai ha⁻¹ followed by oxadiazon at 1.0 kg ai ha⁻¹ (38–70%) compared to the non-treated control. In contrast, the tallest rice plants were observed in the non-treated control and those treated with pretilachlor with safener which had 80–100% rice plant survival. The lowest rice plant survival of 0, 6, 7, and 16% was found in the soil applied with pendimethalin at 2 kg ai ha⁻¹ and saturated at 1, 3, 5, and 7 DAS, respectively, which was followed by oxadiazon at 1 kg ai ha⁻¹. All herbicides except pretilachlor with safener reduced SPAD values with early soil saturation, which improved with delay in soil saturation timing. Pendimethalin at 2 kg ai ha⁻¹ reduced the SPAD values of rice plants by 100–164% relative to the non-treated control and produced the highest phytotoxicity symptoms. Pendimethalin also reduced rice shoot biomass more than oxadiazon, which was compounded by early soil saturation after herbicide application. Pretilachlor with safener was the only herbicide that exhibited low phytotoxic symptoms on rice plants and did not reduce leaf, stem, root, and shoot biomass of rice. Percent reduction in rice leaf, stem, root, and shoot biomass by the different herbicides was in the order of pendimethalin 2 > oxadiazon 1 > pendimethalin 1 > oxadiazon 0.5 > pretilachlor with safener 0.6 kg ai ha⁻¹. Each herbicide treatment reduced rice growth parameters as soil saturation was delayed in the order of 1 DAS > 3 DAS > 5 DAS > 7 DAS. The study suggests that soil water content and herbicide rates are important factors in influencing herbicide phytotoxicity in rice. The application of herbicides should be avoided when the soil is too wet, and irrigation should be delayed at least one week after herbicide application.     

武运粳7号超表达OsNRT1.2 后对硝酸盐的响应

 应用公开的植物基因组数据库和生物信息学分析确定了一个水稻低亲和硝酸盐运输蛋白候选基因OsNRT1.2。利用农杆菌介导Ubiquitin启动子过量表达OsNRT1.2,研究了该基因在武运粳7号中的获得性功能特征。OsNRT1.2的cDNA序列从KOME网站中获得,该序列全长为2178 bp,编码阅读框为1732 bp,编码533个氨基酸。采用半定量RT PCR技术分析,OsNRT1.2在武运粳7号中表达存在器官特异性,主要在根系表达,地上部分几乎不表达。通过将pUbi OsNRT1.2 在武运粳7号中转化,得到OsNRT1.2基因超量表达材料。0.2 mmol/L NO3-和5.0 mmol/L NO3-处理野生型（WT）和T2转基因植株OE1、OE2 和OE8  30 d,每10 d跟踪记录株高和根长。转基因植株（除OE8在5.0 mmol/L NO3-供氮水平外）与WT株高无明显差异,根长增加量显著降低。在0.2 mmol/L NO3-供氮水平下,转基因植株和WT地上部分和根系的全氮含量均无显著差异;在5.0 mmol/L NO3-供氮水平下,除OE1外,OE2和OE8地上部分全氮含量显著增加,3个转基因株系比WT根系全氮含量显著降低。在两个氮素水平处理条件下,转基因植株根冠比都显著降低;生物量比WT都增加,在0.2 mmol/L NO3-供氮水平下增加了9.4% ~ 31.1%,在5.0 mmol/L NO3-供氮水平下增加了12.5% ~ 43.8%。研究表明,OsNRT1.2基因在武运粳7号中可能参与了氮素从根系向地上部的转运,从而导致地上部生物量增加。     

玉米抗寒基因的克隆与表达研究

用DDRT-PCR技术研究玉米自交系承18在常温和不同低温处理下基因表达的变化,分离了10条差异表达的cDNA。序列分析结果表明:其中部分与前人克隆的抗逆cDNA同源,部分与信号传导相关基因同源,部分与功能未知的cDNA同源。用Northern杂交方法对差异片段MCI16做了进一步鉴定,同时还对玉米Cat3、拟南芥CBF1和FAD3基因在不同低温处理的玉米幼苗中的表达特性进行了研究,结果表明:MCI16、Cat3等基因受低温的诱导表达,对提高玉米的抗寒力起积极作用。