J亚群禽白血病病毒gp37基因的克隆和序列分析

近两年我们从国内不同省份先后分离和鉴定了8株J亚群禽白血病病毒（ALV-J），并对其中的5株进行了gp37基因的克隆和序列分析，结果表明，我们分离的5株ALV-J之间的同源性为94.6%-99.0%；与国内最早分离的SD9901，SD9902和YZ9901等毒株之间的同源性分别为95.3%-98.5%,95.6%-99.0%和94.9%-98.6%；与国际最先报道的原型株HPRS-103之间的同源性为93.4%-95.1%；与其它国外毒株的同源性为92.7%-96.8%。这表明我国ALV-J的gp37基因正在不断发生变异，但相对于gp85基因的变异性要小。     

禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白P27基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

从人工感染禽白血病劳斯肉瘤病毒的SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中提取RNA,通过RT-PCR方法扩增出720bp的gag P27基因片段,克隆至pMD18-T载体,酶切鉴定后进行序列测定和分析,表明该片段编码序列与国外RSV分离株(JO2342)的同源性达97.3%.将该片段亚克隆至pGEX-6 P-1原核表达载体,转化受体菌BL-21,经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明目的基因得到高效表达,所表达蛋白是大小为56kD的融合蛋白,占菌体总蛋白的23%.表达产物经Glutathion Spharose4 B树脂亲和层析法纯化后,每100 mL菌液最终可获得5 mg重组t27蛋白,蛋白纯度在90%以上.用兔抗自然P27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组P27蛋白有抗原反应活性.用纯化的重组P27蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应.所制备的重组P27蛋白和多克隆抗体将为禽白血病的诊断及ELISA试剂盒的研制奠定基础.     

禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与序列测定

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒(AEV)序列设计了1对引物，利用RT-PCR技术，从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因，回收、纯化后克隆到T载体中，用常规方法转化JM109感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明，VR株VP3基因全长735bp，共编码245个氨基酸，与AEV-1143标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为93．0％和97．0％；并将其与其他小RNA病毒进行了比较。     

禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗原P^gag27的分离和纯化

本试验用差速离心和非线性蔗糖密度梯度离心法从感染雏鸡血浆中分离和提纯了禽成髓细胞性白血病病毒，并以ＳＤＳ法裂解病毒，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＡＭＶ结构蛋白成分，最后选用水平板式电泳系统，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ比较大量地分离了Ｐ＾ｇａｇ２７。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和琼脂扩散试验检验其抗原活性，并且用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其分子量和纯度，结果表明，提纯的病毒蛋白具有抗原活性，且达到电泳纯。     

禽白血病病毒囊膜基因gp85片段的克隆与鉴定

用ＰＣＲ从禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV)RAV-1,RAV-2感染或未感染的ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）分别扩增出１．２kb囊膜基因片段，分别将上述ＰＣＲ产物的KpnⅠ／SaⅡ酶切片段克隆到质粒pGEM-3zf( )中得到３个重组子即pGEM-3zf-RAV-1env、pGEM-3zf-RAV-2env和pGEM-3zf-Eenv。酶切分析和序列测定结果表明克隆的ＰＣＲ片段分别来自ＡＬＶ ＲＡＶ－１，ＲＡＶ－２和内源生Ｅ亚群病毒，这为病毒囊膜基因gp85的表达及个体鸡遗传抗性的鉴定打下基础。     

J亚群禽白血病病毒膜表面糖蛋白基因gp85的克隆与表达

以pGEM-IMC2.2重组质粒为模板扩增禽白血病病毒内蒙株IMC10200gp85基因，构建了转移栽体pFast Bacl-IM gp85，并利用Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-IMC gp85。转染Sf9细胞后的表达研究表明，重组杆状病毒可高效表达IMC10200的gp85基因，表达产物具有病毒的抗原特异性，与ALV-J单抗JE9有强的间接免疫荧光反应。蛋白质印迹法分析表明，表达产物的分子质量约54ku。     

安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析

为进一步了解J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)gp85基因的结构、功能及其遗传变异趋势,采用PCR方法克隆了安徽省地方品种五华鸡ALV-J gp85基因序列ALV-J-WH,并将该序列与GenBank数据库中登录的15个gp85基因序列进行了比对分析。结果显示,ALV-J-WH与所比对的氨基酸序列同源性介于85.9%~96.2%之间,与其同源性最高的是来自于国内ALV-J毒株的JN378888基因序列,进化树也证实两者亲缘关系较近;此外,相对其他ALV-J gp85氨基酸序列,ALV-J-WH在223位氨基酸后有10个氨基酸的缺失;对所有全长序列分析结果表明,共有71个可变氨基酸位点,10个高度变异位点,尤其是hr1和hr2区域分布较多。结果表明,ALV-J-WH与国内部分ALV-J毒株分离gp85基因来自共同的原始病毒,但其具有独特的序列特征;ALV-J gp85基因高度易变,部分高频率突变的氨基酸位点可能是ALV-J在抗体免疫选择压下的作用位点。     

禽成髓性白血病病毒p27和gag基因的克隆

禽成髓性白血病是由禽成髓性白血病病毒引起的一种禽白血病（Avian Leukosis)。禽成髓性白血病病毒的gag基因具有高度保守性，其编码的群特异性抗原p27是禽白血病病毒所共有的主要核心蛋白，可做为禽白血病的诊断抗原。本实验采用AMV感染鸡胚成纤维细胞（CEF），提取感染细胞总RNA，用随机引物反转录成cDNA，根据已经发表的AMV BAI－A株序列设计两对针对p27基因和gag基因的特异性引物，分别进行PCR，成功地扩出p27基因和gag基因，其片段分别为793bp和2．1Kb。以gag基因的PCR产物为模板，采用p27的特异性引物也成功扩出p27片段。分别将p27,gag基因与pGEM－TEasy载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。对含有p27基因的质粒进行测序，结果证明成功克隆了p27基因，间接证明了2．1Kb的片段是gag基因。p27和gag基因的成功克隆为该病的探针诊断和gag基因的表达提供了基础。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于J亚群禽白血病病毒（ALV-J）原型株HPRS-103基因组碱基#5394-#5416及#7811-#7794的1对引物对PCR，在2000-2001年从山东，河南和宁夏分离的8株ALV-J中，有6株可以扩增出含gp85基因的2.2kb左右的特异性片段，对其中5株的扩增片段做了序列分析，结果表明，这5个毒株的囊膜糖蛋白gp85与原型株hprs-103有93.4%-96.8%的同源性，与我国最早的分离株SD99024有93.7%-98.7%的同源性，它们相互之间的同源性为91.2%-98.7%，由此说明，我国AVL-J的gp85基因正在不断发生变异。     

鸡传染性喉气管炎病毒疫苗株gB基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列，设计了一对引物并以ILTV基因组为模板，经PCR特异性扩增出ILTV疫苗株的gB基因，基因产物大小为2．62kb，与设计相符，并对其进行了序列测定。     

A亚群禽白血病病毒QC6281株的分离与gp85基因序列分析

本试验通过病理剖检、接种DF-1细胞、ELISA及RT-PCR检测,从北京某种鸡场的疑似禽白血病的父母代蛋鸡中分离到1株A亚群禽白血病病毒,命名为QC6281.并根据GenBank中已发表序列设计引物,扩增env基因片段并将其克隆到pMD19-T-simple 载体中,扩增的env基因片段大小为1 239 bp,其中包括完整的gp 85基因,将gp 85基因亚克隆到pMD19-T-simple载体中并测序,gp 85基因大小为1 032 bp,编码344个氨基酸.将env基因片段和推导的氨基酸序列与GenBank中9株ALV的env基因相应序列做同源性分析并制作进化树图谱.发现QC6281与已发表的A亚群禽白血病病毒株该区域核苷酸同源性在83.8%～98%,氨基酸同源性在86.9%～98.5%.其中与Myeloblastosis-associated virus type 1(L10922.1)同源性最高,核苷酸同源性为98%,氨基酸同源性为98.5%;且与Myeloblastosis-associated virus type 1(L10922.1)亲缘关系最近.本研究为该毒株的生物学特性以及致病性研究打下基础.     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的克隆与序列测定

用PCR方法以伪狂犬病病毒闽A株的基因组DNA为模板扩增到了gE基因表位抗原决定域的编码区段。PCR产物连接到pMD18-T载体后，转化大肠杆菌XL1－blue菌株，重组质粒经测序并与GenBank中已登录的gE基因序列比较，确证含有PRV闽A株gE基因的表位抗原编码区，此区段与PRV Rice株相应区段的DNA序列同源性为97．3％，氨基酸序列同源性为94．7％。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据已经发表的伪狂犬病病毒（PRV）Rice株的gE基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号肽以外的全部编码区段,并克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌XL1-blue菌株,重组质粒pMD18-T-FL经酶切和PCR鉴定证实后,进行了序列测定。结果表明,重组质粒pMD18-T-FL含有PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号除信号肽以外的全部编码区段,长1674bp。序列比较分析表明,此区段与PRV Rice株相应区段的核苷酸序列同源性为97．5％,氨基酸序列同源性为94．8％。     

鸡传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白基因(N)的克隆及序列测定

根据IBV病毒已报道基因序列设计了一对用于扩增鸡传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白基因（N）的引物，经RT－PCR得到了预期大小的扩增产物；将目的的条带纯伦并回收以后，克隆到pMD18－T质粒载体中，对插入片段进行序列测定，并与已发表的IBVN基因序列进行了比较和分析，表明具有高度相似性。证明我们克隆了IBVT株的N基因。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。     

A和B亚群禽白血病病毒gp85基因的表达及其抗血清的亚群特异性比较

为制备快速鉴定禽白血病病毒A和B亚群（Avian leukosis virus subgroup A/B,ALV-A/B）的特异性诊断试剂,并鉴定分析ALV-A SDAU09C1株和ALV-B SDAU09C2株抗血清的亚群特异性,将两株病毒的gp85基因进行克隆、原核表达后,免疫家兔分别制备抗ALV-A和ALV-B的血清。血清交叉中和反应显示,SDAU09C1株和SDAU09C2株间的抗原同源性相关系数r=0.366,属于不同亚群;间接免疫荧光表明,两种抗血清均与ALV-A和ALV-B反应,但与ALV-J无反应。结果表明本试验制备的重组蛋白具有较好的反应原性,制备的二种兔抗血清可快速识别ALV-A/B与ALV-J。     

鸡贫血病病毒长春株VP3基因的克隆及序列分析

采用PCR扩增方法成功克隆了鸡贫血病病毒（CAV）长春分离株的VP3基因，并进行了核苷酸序列测定，通过与TK5803、SJ1株进行序列比较，发现长春分离株VP3基因与TK5803仅有1个碱基差异，而氨基酸序列完全相同，与山东SJ1株有3个碱基差异和3个氨基酸差异。