鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验培养条件的初步研究

探讨鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验的最优条件,为鳗鲡的细胞免疫研究提供方法。通过对培养时间、培养温度、小牛血清和刀豆蛋白A(ConA)浓度4个参数的测定,初步确定了鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验四甲基偶氮唑(MTT)法的培养条件。结果表明,在培养时间60 h和68 h,培养温度为18.0℃、24.0℃、30.0℃,RPMI细胞培养液中小牛血清浓度为5%、10%和15%,ConA浓度为0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的范围内,淋巴细胞于18.0℃、含10μg/mL ConA和15%小牛血清的营养液中培养68 h后可获得相对最好的淋巴细胞转化效果。     

香蕉农杆菌介导高效转化体系

以香蕉（Musa spp.)的横切薄层切片（tTCL)外植体作为转化受体，研究影响根癌农杆菌转化香蕉的因素。研究表明，菌液的预处理和重悬液的pH值是影响香蕉转化的主要因子，而乙酰丁香酮（AS）是香蕉遗传转化中必需的酚类物质，80μmol/L是较理想的浓度；感染时间以8－15min，共培养的时间和温度分别以4－5d及26℃为最佳的条件。     

解淀粉芽孢杆菌T1增殖培养基配方及培养条件优化

以解淀粉芽孢杆菌T1为研究菌种,从5种培养基中选出最有利于其生长的基础发酵培养基,并通过单因子试验和正交试验,对基础发酵培养基的配方及发酵条件进行了优化。结果表明,解淀粉芽孢杆菌T1的最优培养基配方为复合氨基酸营养液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最优培养条件为pH 7.0,装瓶量80 mL/250 mL、接种量5%、温度37℃、摇床转速180 r/min、发酵时间36 h。优化后的培养液中解淀粉芽孢杆菌T1活菌数由1.4×109cfu/mL增加至3.5×109cfu/mL。     

磁处理对大蒜胚性愈伤组织生长和体胚发生的影响

以大蒜为试材，研究了磁处理对其胚性愈伤组织生长和发生的效应。结果表明：在0．23T磁感应强度下，0－20min之间的磁处理对大蒜胚性愈伤组织的生长和增殖影响不明显，磁处理时间超过20min后，明显对愈伤组织的生长和增殖产生抑制或破坏作用。5min磁处理能显著地促进大蒜体胚的发生和发育，在10－80min内，随磁处理时间延长，平均每克鲜物质体胚数呈缓慢递增趋势，5－10min磁处理的体胚发育状态更趋成熟。     

小麦花粉电穿孔转化因素优化和转基因植株获得及鉴定

[目的]通过优化电穿孔转化技术主要参数,得到候选转基因植株,探索普通小麦(Triticum aestivum L.)电穿孔遗传转化体系.[方法]以冬小麦品种济麦19为受体,GUS为外源基因,将扬花期成熟花粉以最适电场强度和操作温度进行电穿孔处理后,人工授粉济麦19,最终收获种子;利用PCR技术、Southern技术、化学染色方法对T1、T2植株进行鉴定.[结果]电穿孔转化以电场强度6 kV·cm-1、冰上处理花粉,花粉密度为5×106个/mL,以及去雄后第5天授粉为最佳参数;Southern杂交检测结果表明,T2阳性植株的2个株系检测到杂交信号,同时其幼根、叶片等组织经GUS表达活性的组织化学染色检测,呈现蓝色反应.[结论]利用小麦花粉电穿孔转化法可以成功将外源基因整合到小麦基因组中并稳定遗传至T2,且外源基因GUS能够得到表达.     

根癌农杆菌介导的深绿木霉菌T23遗传转化研究

采用根癌农杆菌介导的方法,成功地建立了丝状生防真菌深绿木霉（Trichoderma atroviride）菌株T23的遗传转化体系。并且,通过提高筛选培养基中潮霉素B的浓度和调整农杆菌的培养时间,对转化体系作了进一步的优化。转化效率约为50个突变体／10^7个分生孢子。所有转化子经继代培养5代,潮霉素B抗性筛选后,共得到118个遗传稳定的转化子。随机抽取部分转化子,进行PCR和soutllem blot分子鉴定,结果证实外源的T—DNA已经随机整合到T23的基因组中。通过形态学观察,筛选出3个在产孢量和菌丝体生长速度方面显著不同于野生型菌株T23的转化子。农杆菌介导的遗传转化方法在深绿木霉菌株T23上的成功运用,将为研究该菌的功能基因组提供强有力的工具。     

以G418抗性为筛选标记的深绿木霉遗传转化研究

【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,并将该质粒通过农杆菌导入深绿木霉T23菌株中,利用G418抗性平板筛选获得转化子,通过PCR对稳定转化子进行鉴定。【结果】T23菌株对G418具有高度敏感性,25μg/mL G418可完全抑制T23菌株的生长;构建的p1300-neo载体是可行的G418抗性标记,通过该载体获得了多株具有G418抗性的深绿木霉遗传转化子。【结论】G418抗性可以作为深绿木霉菌有效的遗传筛选标记,其在PDA培养基中的使用量为25μg/mL。     

嘉宝果叶片多酚提取物的微生物转化及其对抗氧化活性的影响

对嘉宝果叶片多酚提取物进行微生物转化,以期获得一种提高其抗氧化能力的方法.以总抗氧化能力(total antioxidant capacity,简称T-AOC)提高率为指标,研究菌种类型、底物浓度和转化时间对微生物转化的影响,并用高效液相色谱法(HPLC)分析底物的变化情况.结果表明,嘉宝果叶片多酚提取物经过黑曲霉转化后,T-AOC提高最明显,底物浓度、转化时间对转化效果的影响显著,最佳底物浓度为1.0 mg/mL,最佳转化时间为2 d.在最佳转化条件下,嘉宝果叶片多酚提取物的T-AOC由0.506 mmol/L提高至0.818 mmol/L,而多酚含量由0.686 mg/mL下降至0.463 mg/mL.HPLC分析发现,黑曲霉转化嘉宝果叶片多酚提取物后产生了新的强极性物质.     

假单胞菌抗福美双菌株T46的基因文库的构建

从南宁市郊土壤中筛选到的一株杭杀菌剂福美双的抗性菌T46，在福美双浓度达1500μg/mL的GBM平板上仍能生长。经过T46的个体形态，培养特征的观察及生理生化试验，初步鉴定为假单胞菌属第一群铜绿假单胞菌。用广谱性考斯（cosmid）载体pLAFR1,在大肠杆菌ED8767中建立了T46的基因文库。转化子数和重组质粒酶切检查均证明，所构建的基因文库达到了理论要求。     

一类连续模糊控制系统稳定性分析

基于区间矩阵的等价表示方法，将非线性时变的模糊控制系统稳定性分析问题转化为带有时变不确定性的线性系统鲁棒稳定性问题，并且采用最大隶属度的控制方法，得到了T－S模糊系统二次稳定的充分必要条件，仿真结果证明了此方法的有效性和优越性。     

木霉和杀菌剂对香蕉枯萎病菌的抑制作用

对木霉菌株T2、T3、T4、T5、T6、T7和几种杀菌剂对香蕉枯病病菌的抑菌活性测定结果表明,T6菌株对香蕉枯病病菌抑制作用最明显,抑制率为60.74%;敌克松1 000μg/mL、代森锰锌1 000μg/mL、恶霉灵500μg/mL和三唑酮200μg/mL均有较好的抑菌作用,抑菌率均在90%以上。     

根癌农杆菌介导致病疫霉转化体系的建立

为建立低成本、快速、高效的根癌农杆菌介导的致病疫霉转化体系,以菌株 HK0919为材料,从抗生素筛选浓度、共培养转膜方式、乙酰丁香酮（AS）浓度、共培养时间和共培养温度等方面对致病疫霉的转化体系进行了研究。综合各因素优化结果,建立的转化体系条件为：以1．0μg/mL的潮霉素B进行转化子筛选,采用玻璃纸作为共培养介质,AS浓度为200μmol/L,培养6 d,温度为22℃。在此条件下的转化效率为每106个游动孢子获得50～60个转化子。随机选取10个转化子,利用特异性引物对潮霉素抗性基因hph进行PCR扩增,转化子均能扩增出800 bp左右的预期条带;同时,利用根癌农杆菌vir基因特异引物对转化子进行 PCR扩增,排除了转化子被农杆菌污染所致的假阳性;转化子继代培养5代后,仍能在含潮霉素 B的黑麦培养基上生长。说明外源T DNA已成功整合到致病疫霉基因组中,并能稳定遗传。     

E2、P4、OT和PGF2α对猪PBMC活性的影响

应用MTT比色法，以四因素四水平L16（4^5）的正交试验测定E2、P4、OT和PGF2a四种激素对猪的外周血单个核细胞（PBMC）的转化效果。结果显示，所选的4种激素在不同浓度组合时刺激PBMC转化的作用不同。这4种激素对PBMC的转化影响的强度依次为：PGFza、OT、E2、P4。在试验剂量范围内，E2 0.1Pg／mL、P41 ng／mL、OT 10 pg／mL、PGF2a 100 ng／mL时，其共同作用对PBMC转化活性最强。提示在不同生理时期，由于机体内各种激素浓度变化不同，免疫系统也发生相应的变化。     

鹿茸口服液对小鼠免疫功能的影响

研究鹿茸口服液(Pilose Antler Oral Liquid,PAOL)对小鼠免疫功能的影响。用环磷酰胺复制免疫抑制小鼠模型,100只昆明种小白鼠随机分成10组,分别为生理盐水对照组、免疫抑制对照组、免疫抑制小鼠4个灌胃剂量组(0.4 mL/d、0.2 mL/d、0.1 mL/d、0.05 mL/d)以及正常小鼠4个灌胃剂量组(0.4 mL/d、0.2mL/d、0.1 mL/d、0.05 mL/d);测定脾脏重量和腹腔巨噬细胞吞噬功能,比色法测定血清溶血素(HC50),MTT法检测植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)分别诱导的脾脏T、B淋巴细胞转化功能。结果表明,鹿茸口服液0.05 mL可显著增加正常小鼠溶血素水平,其溶血素值达256.067(P<0.01),其中鹿茸口服液0.4 mL、0.2 mL、0.1 mL三个剂量组能够显著提高免疫抑制小鼠溶血素抗体水平(P<0.01);鹿茸口服液0.4 mL、0.1 mL、0.05 mL三个剂量组对正常小鼠T淋巴细胞转化都有较强的促进作用(P<0.01),鹿茸口服液0.1mL剂量组能够显著提高免疫抑制小鼠T淋巴细胞转化功能(P<0.01),0.4 mL剂量鹿茸口服液在促进免疫抑制小鼠B淋巴细胞转化上也体现出明显的效果(P<0.05);其次灌服鹿茸口服液能够增加正常小鼠脾指数,但腹腔巨噬细胞对中性红的吞噬能力相对于对照组没有提高。试验证实,鹿茸口服液能够提高正常小鼠和免疫抑制小鼠机体的免疫功能。     

纳豆芽孢杆菌SFU—18液体深层发酵培养基的优化

采用BPY培养基，在最佳培养条件：温度为37℃、初始pH为7．0、溶氧量为40mL/250mL,230r/min接种量为4％下，测定了纳豆芽孢杆菌菌株SFU－18的生长曲线，从而确定了纳豆芽杆菌的最佳接种种龄以及收获时间。然后，在种子培养液其他成分保持不变的情况下，分别改变氮源、碳源、无机盐、生长因子进行单因素实验（以原种子液为对照），采用L（9）3^4正交表设计实验进行培养基的优化，确定了纳豆芽孢杆菌液体深层发酵的最佳培养基配比为：玉米淀粉1％、豆粕粉5％、玉米浆1．5％、NaClO.2%。     

纳豆芽孢杆菌SFU—18液体深层发酵培养基的优化

采用BPY培养基，在最佳培养条件：温度为37℃、初始pH为7．0、溶氧量为40mL/250mL,230r/min接种量为4％下，测定了纳豆芽孢杆菌菌株SFU－18的生长曲线，从而确定了纳豆芽杆菌的最佳接种种龄以及收获时间。然后，在种子培养液其他成分保持不变的情况下，分别改变氮源、碳源、无机盐、生长因子进行单因素实验（以原种子液为对照），采用L（9）3^4正交表设计实验进行培养基的优化，确定了纳豆芽孢杆菌液体深层发酵的最佳培养基配比为：玉米淀粉1％、豆粕粉5％、玉米浆1．5％、NaClO.2%。     

二甲基苯蒽诱导山羊乳腺上皮细胞体外转化研究

分别用5,10和15μg／mL二甲基苯蒽(DMBA)的完全培养液处理体外培养的山羊乳腺上皮细胞36, 24和12 h,再以25 ng／mL佛波酯(TPA)作用2周,研究DMBA和TPA对山羊乳腺上皮细胞的诱导转化作用,确定最佳诱导转化条件,探讨二甲基亚砜(DMSO)对细胞增殖的影响。结果表明,用含15μg／mL DMBA的完全培养液培养12 h,再用TPA连续作用4 d,几乎无山羊乳腺上皮细胞存活,10μg／mL DMBA培养24 h转化效果较差,5μg／mL DMBA培养36 h转化效果最佳;转化的山羊乳腺上皮细胞体积增大、核浓缩、生长排列紊乱、无规则并出现转化灶; DMSO对细胞生长有抑制作用．随培养时间延长抑制作用减弱。试验初步建立了乳腺上皮细胞的体外转化系统。     

提高棉花杂交成铃的途径

试验表明，棉花开花时间与杂交成铃呈直线负相关，ｒ＝－０．９８１＾＊＾＊，回归方程ｙ＝１７３．７２－３．９５ｘ，开花时间对杂交成铃的递减率为３．９５％；密度与杂交成铃的转化值亦呈高度负相关，ｒ＝－０．９５８＾＊＾＊，密度每增加１０００，转化值的递减率为９．０３％（杂交成铃的递减率则为１７．７６％）。此外，内围铃的杂交成铃率是外围铃的２倍，摘取幼蕾可使杂义成铃率提高２２．５％。     

柔嫩艾美耳球虫各阶段虫体纯化方法的改进

本文报道了改进的柔嫩艾美耳球虫各阶段虫体纯化方法。用胃蛋白酶消化盲肠道组织，铜筛过滤除去大颗粒杂质后，以1．1mol·mL－1蔗糖离心漂浮卵囊，然后用小于0．5mol·mL－1蔗糖溶液反复漂洗，最后以5％次氯酸钠消毒处理，获得了大量纯化柔嫩艾美耳球虫卵囊。孢子化卵囊经研磨，消化，游离出子孢子后，过DEAE-纤维素52层析柱，以0．05mol·mL-1，Tris－HCl，（pH＝80，0．15mol·mL1-NaCl）洗脱，层析往高5cm，洗脱液水柱高3cm，流速为2mL·min－1，纯化出了子孢子。取人工感染球虫鸡的120h后的盲肠，游离出第二代裂殖子，铜筛过滤后，过柱方法同前，纯化出了第二代裂殖子。结果证明本法分离的子孢子和第二代裂殖子活性好，回收率达87％。     

睾酮单克隆杂交瘤细胞株的筛选及性能鉴定

为建立大批量样品中睾酮残留的检测方法,采用细胞融合技术、间接ELISA和间接竞争ELISA(icELISA)等方法,对睾酮单克隆杂交瘤细胞株进行了筛选及性能鉴定。结果表明:筛选出5株(T2C3,T2D9,T3A5,T4B1、T4E8)杂交瘤细胞,抗体亚类均为IgG1型,具k轻链,亲和常数为4.38×108～5.24×109 L/mol;腹水纯化后的抗体效价和灵敏度(IC50)分别为0.64×105～2.56×105和1.58～2.92ng/mL。以T2D9细胞株建立icELISA标准曲线,其线性范围为0.06～63.5ng/mL,检测限和IC50值分别为0.04和1.55ng/mL。