棉花角斑病菌hpaXm基因突变体 与互补载体构建

为了分析研究Harpin 蛋白转运途径,针对来自棉花角斑病菌的HpaXm,构建hpaXm 基因突变体和互补 载体,根据文献和GenBank 中已登录的hpaXm 基因全序列及其同源基因hpa1 的序列,设计合成多对引物进行PCR 扩增,并将扩增片段与载体相连接,用电转化的方式将构建成功的hpaXm 基因敲除载体转化Xanthmonas citri subsp. malvacearum,然后测定hpaXm 基因突变体在烟草上激发HR 的能力。结果得到hpaXm 基因上游序列349 bp,hpaXm 基因下游序列465 bp;利用重叠PCR 将hpaXm 基因上下游序列融合,克隆到自杀载体pK18mob 的酶切位点BamHI 和EcoRI 之间,并将pK18mobhpaXm 上下游融合片段转化大肠杆菌E.coli DH5琢,经卡那霉素平板筛选得到阳性转 化子;将hpaXm 基因敲除载体转化X. citri subsp. malvacearum,经PCR 验证成功敲除hpaXm 基因,并发现hpaXm 基 因突变体在烟草上激发HR 的能力要弱于“生型菌株。扩增得到hpaXm 基因片段402 bp 和信号肽类似序列缺失 hpaXm46-402 基因片段360 bp,克隆到广宿主载体pHM1 的KpnI 和SacI 酶切位点之间,并将pHM1hpaXm 和 pHM1hpaXm46-402转化E.coli DH5琢,经壮观霉素平板筛选得到阳性转化子。重组质粒经PCR 检测、测序鉴定及突变体 在烟草上的表型验证,表明hpaXm 基因突变体和互补载体构建成功,为hpaXm 基因回复突变株的构建和进一步研 究信号肽序列缺失对HpaXm 蛋白转运的影响奠定了基础。     

广西橡胶树棒孢霉落叶病病情调查与病原鉴定

由多主棒孢(Corynespora cassiicola)引起的橡胶树棒孢霉落叶病是继南美叶疫病之后最具破坏性的橡胶树叶部病害,该病已在东南亚主要植胶国造成严重危害.本文首次报道了广西橡胶树棒孢霉落叶病病情调查结果,并通过病害诊断、病原菌基础生物学特性测定和分子分析,明确该病病原为多主棒孢病菌[Corynespora cassiicola(Berk et Curt.)Wei].     

大丽轮枝菌VdLac基因克隆与功能分析

为探讨漆酶基因VdLac在大丽轮枝菌中的功能,克隆该基因并利用农杆菌介导的遗传转化方法和PEG介导的原生质体转化方法对VdLac进行敲除和功能回复,获得敲除和互补突变体。以野生型JY为对照,对敲除突变体和互补突变体进行生物学功能测定。结果显示,VdLac基因全长1 978bp,cDNA序列全长1 713bp,编码570个氨基酸组成的蛋白质;VdLac基因缺失突变体(△VdLac)对硝化压力更敏感,其在CM培养基上仍可产生漆酶,但产生漆酶的能力降低;表明大丽轮枝菌漆酶基因VdLac不影响菌株的营养生长、产孢、致病力以及黑色素合成。     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌寄主范围测定

以43科74种热带胶林杂草、果树、园艺植物为供试植物,通过离体叶片接种法,测定了巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌的寄主范围。结果表明,该病菌能侵染葫芦科、无患子科、大戟科、番木瓜科、锦葵科、菊科、茄科、旋花科、苋科、豆科、天南星科、木樨科和楝科共13科24种植物。     

巴西橡胶树乳管高效表达焦磷酸酶基因的双元表达载体的构建

以巴西橡胶树叶片为材料提取DNA,用特异引物经PCR扩增获得了378 bp的REF启动子片段,该片段序列与NCBI报道的REF序列间的同源性分别是98.68 %和99.47 %。以胶乳为材料提取总RNA,用特异引物经RT-PCR方法获得了2310 bp的V-PPase基因片段,该片段序列与NCBI报道的V-PPase基因序列一致。通过酶切和连接,将克隆的两个片段重组到植物表达载体pCAMBIA1301, pCAMBIA2301和pCAMBIA3301中,构建了分别含有潮霉素磷酸转移酶基因（hpt Ⅱ）、新霉素磷酸转移酶基因（npt Ⅱ）和抗除草剂基因（bar）的三种橡胶树乳管高效表达V-PPase基因的载体pC1301RV、pC2301RV和pC3301RV。然后用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105,为进一步转化橡胶树奠定基础。     

过氧化氢酶BcCAT2在灰葡萄孢生长发育和致病过程中的功能初探

为了明确灰葡萄孢过氧化氢酶BcCAT2在病菌生长发育时期和侵染过程中的功能,本研究利用生物信息学方法,对BcCAT2及其编码蛋白进行分析;构建了BcCAT2敲除载体,利用原生质体转化方法,获得了BcCAT2敲除突变体;利用PCR和qRT-PCR技术,对所获得的转化子进行鉴定;对野生型菌株和△Bccat2的表型（菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等）和致病力进行分析。结果发现,BcCAT2基因的缺失会导致菌丝形态纤细、生长速度缓慢、几乎不产菌核和分生孢子,且致病力明显下降,表明BcCAT2基因正调控病菌的生长发育和致病力。研究结果为进一步阐明灰葡萄孢过氧化氢酶BcCAT2基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制奠定了基础。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

栗疫菌CpIAP基因生物信息学分析及功能研究

寻找栗疫菌的凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)类蛋白,明确该蛋白与其他物种IAPs的进化关系,并对CpIAP基因功能进行初步研究.以IAPs家族的典型结构域“BIR”为靶标,对栗疫菌基因组数据库进行BLAST搜索.运用生物信息学对预测的CpIAP蛋白结构进行分析并构建系统进化树;采用同源重组的策略,构建CpIAP基因缺失突变体,并重新导入该基因全长片段获得互补株.结果从栗疫菌中鉴定了1个IAP基因,Southern blot验证为单拷贝.生物信息学分析表明:CpIAP基因全长2 997 bp,编码920个氨基酸,具有2个BIR结构域;进化关系上CpIAP与人Survivin和酵母IAP较近.CpIAP敲除突变体命名为△IAP,△IAP菌落形态改变,生长速率减慢,致病力下降,丧失产孢能力.上述结果表明:CpIAP参与了栗疫菌的菌落形态建成、分生孢子形成和致病过程.     

玉米大斑病菌黑色素合成还原酶基因酵母单杂交报告载体的构建

根据玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)黑色素合成还原酶基因St3HNR、St4HNR 5′端侧翼序列和酵母单杂交报告载体p HIS2.1多克隆位点,设计了带有限制性内切酶位点的特异性引物,并以玉米大斑病菌01-23菌株基因组DNA为模板,PCR扩增启动子区域长度约1 000 bp的片段,双酶切目的片段及载体p HIS2.1回收并连接,构建2个还原酶基因的酵母单杂交报告载体。结果表明,克隆到启动子区域长度为998 bp核酸片段,经PCR检测、测序、酶切鉴定,2个还原酶基因的酵母单杂交报告载体构建成功,为进一步研究还原酶与转录因子互作关系及明确黑素素合成调控机制奠定了基础。     

牛SRY基因的克隆与测序

以牛基因组DNA为模板,在一对特异性引物的引导下,利用PCR技术成功地扩增了牛SRY基因。纯化回收目的片段,克隆到pMD 18-T载体上,筛选阳性克隆测序,得到SRY基因两端的序列(5′端641 bp,3′端786bp)。与网上公布的牛SRY基因序列进行同源性比较,结果显示,牛SRY基因长度为2 713 bp,克隆的5′和3′端2个片段与网上公布的牛SRY基因序列对应片断的同源性分别为98.7%和98.1%。     

辣椒炭疽病菌效应因子NIS1-PCR-RFLP标记系统的建立

【目的】基于辣椒炭疽病菌种群复杂、田间复合侵染种群组成不清,导致防控相对困难的问题,建立一种快速直观的辣椒炭疽病菌区分标记系统,为其病害田间防控提供科学依据。【方法】利用rDNA-ITS通用引物克隆田间分离的22株辣椒炭疽病菌rDNA-ITS,通过其序列比对分析构建系统发育进化树,初步确定22株供试菌株的种类和分类地位;选用效应因子NIS1基因为靶标,根据辣椒胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和黄瓜炭疽菌（C.orbiculare）NIS1基因比对分析,设计NIS1基因简并引物,克隆22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因,利用其序列比对分析构建系统发育进化树,分析比较rDNA-ITS和NIS1基因区分供试菌株的差异,进而对22株不同辣椒炭疽病菌NIS1基因进行分析,选择限制性内切酶,分析NIS1基因的PCR产物限制性片段多态性（RFLP）差异,建立NIS1-PCR-RFLP标记系统。【结果】rDNA-ITS序列系统进化分析表明22株辣椒炭疽病菌属于5种炭疽病菌,即胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、短孢炭疽菌（C.brevisporum）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）、平头炭疽菌（C.truncatum）和黑点炭疽菌（C.capsici）,其序列同源性为85.6%~99.8%,但C.capsici和C.truncatum处于同一混合组群;22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因两端序列较保守,中间存在可变区,与已报道的C.orbiculare的NIS1基因同源性在34.6%~78.9%;NIS1基因系统发育进化树能将22株辣椒炭疽病菌分成5个组群,C.capsici和C.truncatum处于不同组群,表明其区分度优于rDNA-ITS;NIS1-PCRRFLP主要差异片段显示C.gloeosporioides和C.brevisporum的最大片段均为210 bp,但片段数目不同,而C.acutatum为292 bp,C.capsici为685 bp,C.truncatum为345 bp,参照菌株C.orbiculare为497 bp,能够直观观察区分。【结论】研究建立的NIS1-PCR-RFLP标记系统可简便、直观地区分不同辣椒炭疽病菌的差异,有望发展成为真菌新的分子标记应用于田间辣椒炭疽病菌种群的快速鉴定。     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体的筛选及Vmzfp3基因的功能分析

本研究采用接种离体枝条的方法,对150个苹果树腐烂病菌的T-DNA插入突变体库中的突变体进行了致病性的筛选,经过多次试验得到了3个致病力明显减弱的突变体,编号为X4379,X4368,X4468。基因组重测序结果显示,突变体X4379有2个T-DNA插入位点,分别是锌指蛋白3(Vmzfp3)和跨膜蛋白42(Vmtme42)。以苹果树腐烂病菌的全基因组序列为依托,设计引物,构建敲除载体以及互补表达载体。运用PEG的方法转化苹果树腐烂病菌,分别获得Vmzfp3和Vmtme42的敲除转化子和互补转化子。对Vmzfp3和Vmtme42基因敲除转化子、互补转化子以及野生型苹果树腐烂病菌菌丝形态和致病力进行分析。与野生型菌株03-8相比,Vmzfp3的敲除转化子的菌丝生长速率明显减慢,致病力也明显下降,其互补转化子使得这些功能缺陷均得以恢复。Vmtme42的敲除转化子无明显区别。由此证明基因Vmzfp3对病菌的菌丝生长,病菌的致病力具有调控作用。     

香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种mon1基因敲除转化子的表型分析及致病力测定

根据笔者实验室前期蛋白质组学研究成果,发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中的mon1基因影响了尖孢镰刀菌的致病性,为了研究mon1基因在Foc4侵染香蕉过程中的具体作用,利用同源重组方法敲除了Foc4的mon1基因,并对获得的敲除突变体开展表型分析和致病性测定。结果表明,与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝变细,分支减少及产孢量降低,菌株抵抗外源氧胁迫、细胞壁穿透能力、纤维素利用能力减弱,对巴西蕉苗的致病力明显减弱。由此推测mon1基因在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有一定的作用。     

灰葡萄孢致病基因BcPDR1与Gα亚基基因的关系研究

为了探究灰葡萄孢致病基因BcPDR1与病菌G蛋白α亚基基因之间的关系,利用qRT-PCR技术分析BcPDR1基因突变对Gα亚基基因BcBCG2和BcBCG3表达的影响以及BcBCG2、BcBCG3基因突变对BcPDR1基因表达的影响;在敲除突变体ΔBcpdr1的基础上,构建BcBCG2、BcBCG3基因过表达菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE,对过表达菌株的表型和致病力进行分析。结果发现,BcPDR1基因的缺失突变体中BcBCG2、BcBCG3基因的表达水平显著升高,BcBCG2、BcBCG3基因沉默突变体中的BcPDR1基因的表达水平显著降低;BcBCG2、BcBCG3基因的过表达菌株的菌落形态、菌丝形态、生长速率、产孢量和致病力均与野生型BC22菌株基本一致,而与ΔBcpdr1突变体存在显著差异。结果表明,灰葡萄孢BcPDR1与Gα亚基基因BcBCG2、BcBCG3之间密切相关,BcPDR1负调控BcBCG2、BcBCG3基因的表达,BcBCG2、BcBCG3正调控BcPDR1基因的表达。研究结果为阐明灰葡萄孢致病基因BcPDR1调控病菌生长发育和致病力的机制奠定了基础。     

大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体。[方法]利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因。用限制性内切酶EcoRI和Not1分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体。[结果]扩增的大豆疫霉菌pspgl基因成熟肽片段大小为1250bp。用基因特异性g}物扩增阳性重组子,可得到大小为1200bp的片段。而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1200和1700bp两条带,多出来的400bp恰好符合载体部分的大小。将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中。[结论]该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础。     

苹果树腐烂病菌根皮苷水解酶基因Vmlph1的功能

为明确根皮苷降解酶在苹果树腐烂病菌侵染过程中的作用,从苹果树腐烂病菌基因组序列中鉴定出候选根皮苷降解酶基因Vmlph1,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术构建Vmlph1敲除突变体,观察突变体营养生长状况、产孢情况以及致病力的变化;利用HPLC方法检测基因敲除对根皮苷降解速率的影响。结果发现,经PCR及Southern blot验证后获得Vmlph1基因的敲除突变体;与野生型菌株相比,突变体菌落颜色变白,生长速率和产孢能力显著降低;接种到叶片和枝条上,突变体致病力显著降低;突变体根皮苷降解能力与野生型没有显著差异;在根皮苷诱导下,野生型菌株黑色素合成调控转录因子Cmr1基因的表达量显著上调,但突变体Cmr1基因的上调倍数显著低于野生型菌株。表明,根皮苷降解酶基因Vmlph1与苹果树腐烂病菌营养生长、致病力、分生孢子的产生及黑色素合成有关。     

稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015的T-DNA标记基因的克隆

【目的】研究稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）致病力丧失突变菌株B-1015,克隆和分析T-DNA插入位点的侧翼序列,为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体B-1015菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及致病力等生物学表型。用PCR检测T-DNA在B-1015基因组中插入的稳定性,用Southern杂交检测T-DNA插入的拷贝数,用hiTail-PCR扩增T-DNA侧翼序列,用RACE PCR克隆T-DNA标记基因,半定量RT-PCR分析所克隆基因的表达情况。【结果】与野生菌株P1相比,突变菌株B-1015的生长速率和产孢量都有较明显的降低,孢子萌发率无明显差异,致病力丧失。分子检测结果表明T-DNA在B-1015基因组中为稳定的单拷贝插入。hiTail-PCR得到的T-DNA两端侧翼序列在野生型菌株基因组上不相连,RACE PCR在两边的侧翼序列上分别克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。预测分析表明Uvt-1015R包含一个长度为948 bp的开放阅读框（open reading frame finder,ORF）,可编码295个氨基酸,5′端非编码区（5′-untranslated regions,5′-UTR）长度为 341 bp,3′端非编码区（3′-untranslated regions,3′-UTR）长度为271 bp。Uvt-1015L包含一个长度为351 bp的ORF,可编码116个氨基酸,5′-UTR为31 bp,3′-UTR长度为174 bp。在已知功能的蛋白中检索,没有发现与Uvt-1015R和Uvt-1015L基因同源的蛋白。序列分析发现T-DNA插入在两个基因序列中间,RT-PCR结果显示,在突变菌株B-1015中,Uvt-1015R表达量下降,Uvt-1015L不表达。【结论】 稻曲病菌突变菌株B-1015致病力等重要生物学表型发生改变,可能是由于T-DNA的插入导致了B-1015基因组重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L基因结构的破坏。     

玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的克隆与基因表达分析

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用pET原核表达系统对Stga-2成功进行了异源表达。生物信息学分析表明,Stga-2全长1318bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码产物包含356个氨基酸残基。在347bp的上游侧翼序列中未发现典型的TATA-box及CAAT-box,但在起始密码子上游30bp处发现了转录起始子特征序列及位于其上游能够起始真菌基因转录的C+T丰富区域,同时还有转录因子Sp1的识别位点、CCA基序(CCAmotif)及CCG重复基序(CCG repeats)等顺式作用元件。【结论】玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的成功克隆与表达进一步丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。     

内生芽孢杆菌BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因与定殖相关性

【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因（β-1,4-endoglucanase gene,eglS）,探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物,以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段,与具有单交换功能的整合载体pMUTIN-GFP+连接构建敲除质粒。eglS的过表达质粒和敲除质粒转化芽孢杆菌感受态细胞分别获得过表达突变体和敲除突变体。将过表达质粒转化敲除突变体感受态细胞获得互补突变体。采用荧光显微镜观察、PCR、平板酶活力检测及实时荧光定量PCR方法鉴定突变体。3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定突变体和野生菌的β-1,4-内切葡聚糖酶活力,同时采用定量灌根接种法检测不同菌株30 d内在小白菜各组织中的定殖数量。【结果】获得在荧光显微镜下呈现绿色荧光的过表达突变体和互补突变体。PCR检测结果表明敲除突变体中能够扩增出675 bp的目的条带,而以野生菌株和整合载体DNA为模板扩增时没有对应条带,成功得到敲除突变体。野生菌及各突变体β-1,4-内切葡聚糖酶平板活力检测结果显示,野生菌BS2只有一个水解圈且透明,过表达突变体与互补突变体有大于野生菌的双水解圈,内圈的水解圈透明,外圈的水解圈不透明。敲除突变体沿菌体边缘也有一个小水解圈。实时荧光定量PCR的分析结果证实野生菌及突变体间β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量存在差异,过表达突变体和互补突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量增高,分别是野生菌的111和82倍;敲除突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量相对于野生菌BS2几乎为0。突变体与野生菌在小白菜体内定殖数量以及酶活力检测结果表明,在相同的小白菜组织以及相同的分离时间内,敲除突变体的定殖数量最少,其在根茎叶中的定殖数量与其他菌株相比均有显著性差异（P＜0.05）。敲除突变体的酶活力也显著低于其他菌株（P＜0.05）。过表达突变体的酶活力以及在小白菜体内的定殖数量在P＜0.05水平上显著高于敲除突变体和野生菌,互补突变体的酶活力和在小白菜体内的定殖数量与过表达突变体基本一致。【结论】内生芽孢杆菌BS2菌株β-1,4-内切葡聚糖酶的活力高低与其在小白菜体内的定殖数量之间呈正相关关系,其表达的β-1,4-内切葡聚糖酶在定殖过程中发挥一定作用。     

橡胶树白粉病菌OhPbs2的克隆及功能分析

【目的】Pbs2是MAPK信号途径HOG-MAPK通路的重要成员之一,在植物病原菌渗透压调节方面发挥着重要作用。橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)是专性寄生菌,论文借助橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),研究橡胶树白粉病菌OhPbs2的功能。【方法】采用同源克隆方法,分别以橡胶树白粉病菌基因组DNA和c DNA为模板,PCR扩增OhPbs2;利用生物信息学分析该基因的结构域,对该基因和其他真菌的7个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用MEGA6中最大简约法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;利用同源重组和原生质体转化技术,将OhPbs2转化到缺失Pbs2的橡胶树炭疽菌突变体ΔCgPbs2中;在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上筛选转化子,同时提取转化子的基因组作为模板,用橡胶树白粉病菌OhPbs2的引物对进行PCR鉴定,选择正确的转化子ΔCgPbs2+OhPbs2进行后续表型测定;在不同培养条件下,比较ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和野生型菌株生长状态,并在橡胶树叶片接菌检测3个菌株致病力。【结果】OhPbs2基因序列全长1 927 bp,c DNA序列全长1 860 bp,含有一个内含子,编码一个619个氨基酸的蛋白;生物信息学分析表明该蛋白具有与Cg Pbs2相同的S_TKc功能域,构建系统进化树发现橡胶树白粉病菌Pbs2蛋白与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Pbs2蛋白亲缘关系最近,相似度为55%,与橡胶树炭疽病菌的相似度为49%,与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的Pbs2蛋白具有较近的亲缘关系,相似度分别为54%、53%、53%、50%;ΔCgPbs2+OhPbs2菌株能在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇培养基上长出白色菌落,ΔCgPbs2菌株不能生长,并且测序结果显示OhPbs2已成功转入ΔCgPbs2;ΔCgPbs2+OhPbs2在MM培养基上菌落呈白色,气生菌丝较短,不同于wild type菌株。在含有不同浓度Na Cl、山梨醇、SDS、H2O2及咯菌腈的MM培养基上,ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和wild type菌株随着浓度增加,菌落生长速度逐渐降低,OhPbs2不仅能恢复橡胶树炭疽菌菌株耐渗透压尤其耐受山梨醇的能力以及对咯菌腈的敏感性,甚至具有增强的能力,OhPbs2互补改变了橡胶树炭疽病菌颜色,抑制了气生菌丝生长;Cg Pbs2可能参与了橡胶树炭疽病菌致病性,但OhPbs2互补没有恢复其致病性。【结论】OhPbs2可能参与调控病菌的营养生长、氧化应激反应、渗透压响应及细胞壁形成等,并能增强橡胶树炭疽病菌相应功能,但与Cg Pbs2调控病菌致病力的机制可能存在不同。