大肠杆菌HB101感受态细胞制备条件的优化

为探讨大肠杆菌HB101感受态细胞制备的最优条件,从菌种来源、感受态细胞的生长状态及其储存方式等3个方面进行了优化。结果表明：从-70℃冰箱中保存的菌种活化大肠杆菌HB101,当细胞的OD600值为0.3～0.4时制备感受态,4℃冰箱放置1d,-70℃下放置1个月,均可获得较高的转化效率,每微克DNA最高可达1.18×107cfu。     

一种简捷有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法

[目的]探索建立简捷快速有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法。[方法]在已有的TSS法基础上进行了进一步的改进,建立了一个只需一步室温离心便能够获得与常规方法效价相近,能够长期保存的大肠杆菌感受态细胞的制备方法。[结果]新方法制备的感受态细胞每微克转化菌落数达105~106个,可以满足在质粒中进行的常规克隆需要。不同冻存时间对新方法制备的感受态细胞转化效率无显著影响。新方法制备的感受态细胞可以立即使用也可以于-80℃下长期保存至少9个月不会影响其转化效价。这也与常规CaC l2法制备的感受态细胞性能相当。[结论]该方法为一次大量制备并长期保存使用感受态细胞奠定了基础。     

大肠杆菌感受态细胞保存条件的研究

研究了保存时间、温度和抗冻剂对大肠杆菌感受态细胞保存的影响。结果表明：在4℃-、40℃、-70℃条件下,大肠杆菌感受态细胞转化效率在保存前期随保存时间增加呈上升趋势,转化效率在第1天或第7天达到最大值,此后随保存时间增加而呈下降趋势;在保存前期,保存于4℃的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,在保存后期低于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率;在相同保存温度和保存时间下,保存在甘油的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在DMSO的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。     

大肠杆菌感受态细胞转化能力影响因素的研究

探讨了大肠杆菌生长状态、转化溶液浓度、保存温度、冰上放置时间对感受态细胞转化能力的影响.结果表明,以100 mmol/L CaCl2为缓冲液,采用经活化培养的A6000.56的大肠杆菌JM109制备的感受态细胞,在冰上放置6h后转化,所得转化率最高.若感受态细胞要保存备用,液氮保存最好,其次-70℃,添加20%甘油利于冷冻保存,但添加保护剂对转化率有抑制作用.     

温度对大肠杆菌感受态细胞的影响

在不同的培养温度下制备一系列大肠杆菌感受态细胞，并选取其中一组感受态细胞在4种不同的温度下保存，对培养温度与大肠杆菌感受态形成的关系以及感受细胞在不同保存温度下的保持情况进行了研究。结果表明，不同培养基温度下大肠杆菌生长出现高峰期不同。其中，18℃和25℃，出现于对数期早期，而30℃和37℃则出现于对数期中后期。在25℃条件下转化效率最高。感受态细胞在4种不同温度条件下保存，受活菌数和感受态2种因素的影响程度都不同。转化效率在前期都有不同程度的提高，液氮条件下保存感受态细胞时间最长。     

根癌农杆菌感受态细胞的制备及保存方法研究

研究不同培养基、转化溶液、保存方法对根癌农杆菌感受态细胞转化率的影响,确定高转化率根癌农杆菌感受态细胞的制备及保存方法。结果表明,使用YEB培养基,单菌落接种培养过夜后以1∶100的比例扩大培养10.5 h,用20 mmol/L CaCl2＋80 mmol/L MgCl2溶液处理,所制备新鲜感受态细胞的转化率为1.59×10^5转化子/μg质粒DNA。浓度为7%的DMSO对新鲜感受态细胞保存效果较好。     

高效JM109感受态细胞制备及转化条件的优化

采用不同的转化液制备大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞,并进行pUC18质粒的转化,考察细菌生长状态、转化液、转化的热激时间和转化后所用培养基对转化率的影响.结果表明,菌液A600nm为0.705时采用TB转化液制备感受态细胞,在42℃热激45 s,转化后采用SOC培养基振荡培养,转化效率最高,可达8.59×108 CFU/μg质粒.     

一步法制备大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞及转化条件优化

大肠杆菌BL21(DE3)菌株是大肠杆菌表达系统最常用的宿主菌株,因此人们需要1种便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。一步法感受态细胞制备操作方便,只加1种试剂即可,更快捷稳定,转化也更方便,不需要热激。研究大肠杆菌感受态细胞一步法制备对BL21菌株的适用性,并对转化过程中的关键参数进行探索和优化。结果表明,该一步法制备的BL21菌株感受态细胞可获得106CFU/μg DNA转化效率,完全能够满足常规转化要求。转化过程中相关参数的最佳条件为冰水浴30 min,室温放置10 min,37℃、150 r/min振荡复苏40 min。     

枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2电击转化体系的建立

[目的]建立枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株ZT4-2的高效电击转化体系.[方法]带有荧光蛋白标记的穿梭质粒pGFP78,通过电击转化法将其转入枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2.[结果]菌株培养阶段、感受态细胞浓度、感受态细胞量、质粒体积量、转化电压等条件的不同,会对电击转化效率造成影响.其中试验条件:制备感受态细胞的菌株培养阶段的OD600nm值=1.0,重悬菌体时每100 mL起始菌液加入600 μL的40％PEG6000;电击转化体系中,感受态细胞量200 μL,质粒体积10 μL,转化电压2.5 kV.最高转化效率可达6 823.67 CFU/μg.[结论]建立了枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2的电击转化体系,电击转化效率较高.     

根癌农杆菌感受态细胞的制备以及质粒ProkⅡ对其转化的研究

研究了根癌农杆菌LBA 4404和C58C1生长的培养基类型、菌株生长状态、转化溶液、质粒与感受态细胞共放置时间、质粒加入量、液氮速冻时间及热激条件对质粒P rokⅡ转化的影响。结果表明,以70 mm o/L C aC l2作为转化溶液,YEB培养基制备的、OD600为0.5的LBA 4404感受态细胞与10 ng质粒DNA,于0℃共放置30m in,液氮速冻5 m in,37℃热激5 m in时转化率最高,达1.40×105μg-1;以70 mm o/L C aC l2作为转化溶液,YEB培养基制备的、OD600为0.5~0.6的C58C1感受态细胞与20 ng质粒DNA,于0℃共放置10 m in,液氮速冻1 m in,37℃热激1 m in时转化率最高,达1.33×105μ-g 1。     

大肠杆菌感受态细胞制备及转化研究现状

大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)又称大肠杆菌,因结构简单、遗传背景明确而成为基因克隆实验中最常用的受体菌种。感受态细胞的制备与转化是生物转化实验中的重要环节,大肠杆菌感受态细胞的转化效率直接影响携带目的基因的重组质粒能否导入受体细胞,表达出新的遗传性状。大肠杆菌感受态细胞(competent cells)制备常采用物理或化学方式改变细胞膜通透性,诱导受体菌摄取外源性DNA并整合入受体菌。此外,细菌细胞密度值(OD_(600))、转化液浓度、热激参数、培养条件等因素也影响转化效率。综述了国内外大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法,以期为各大实验室制备和转化大肠杆菌感受态细胞提供参考。     

电转化条件对大肠杆菌TG1转化效率的影响

研究探索不同条件对TG1大肠杆菌转化率的影响,以探索最适合电转化条件。研究通过对细菌生长曲线绘制,改变不同生长阶段、感受态细胞浓度、转化后复苏液以及复苏时间、电转化参数、质粒浓度、抗生素浓度等影响电转化率的条件,探索最适合的电转化条件。结果表明,TG1大肠杆菌37℃、170 rpm/min震荡活化培养时间3 h后,以电压1 800 V、电容25μF、电阻200Ω进行电击转化,以LB液体对电击细胞复苏45 min,为最佳转化条件。该结果具有可重复性,为后续建立基因文库奠定良好基础。     

大肠杆菌感受态细胞的少量制备方法及转化条件研究

[目的]提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率。[方法]根据普通实验室的试验条件,总结出1种少量制备大肠杆菌感受态细胞并高效率转化质粒的方法。[结果]利用该方法少量制备大肠杆菌感受态细胞,在OD600nm值为0.3～0.6时均可达到高转化率的效果。与常用的大量制备法相比,该方法的转化率提高100～300倍。[结论]该方法简单方便、重复性好、转化效率高、成本低,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究的要求,是从事基因克隆研究方面的科研人员的良好选择。     

冰浴时间对氯化钙转化法转化效率的影响

确定大肠杆菌DH5α氯化钙转化法时感受态细胞与质粒混合物的最佳冰浴时间。方法:在保证其他条件一致的情况下,设置大肠杆菌感受态细胞和质粒混合物的冰浴时间梯度并建立阴性对照进行研究。结果:冰浴20 min时转化效率最高。结论:与其他冰浴时间相比,冰浴20 min时的转化效率最高,实验重复性好,成本低廉,而且操作简便,值得推广使用。     

超重力处理对大白菜生理生化特性影响的研究

以新丰抗90白菜种子为试验材料,在1 000×g、2 000×g、4 000×g 3种不同超重力的条件下分别处理20、40、60 min后,幼苗期采取叶片测定其游离脯氨酸含量、过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性。结果显示,2 000×g,40 min处理游离普氨酸含量最低;4 000×g,60 min处理游离脯氨酸含量最高,与对照相比,所有处理均抑制游离普氨酸的形成。1 000×g,20 min处理后的POD活性最高;2 000×g,60 min处理后的POD活性最低,但高于对照,超重力处理能显著提高POD活性。1 000×g,40 min处理SOD活性最高,4 000×g,60 min处理SOD活性最低,适宜的超重力处理有利于提高SOD活性。     

影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究

通过对EHA105菌株48h不间断培养观察,绘制出其生长曲线图;同时用不同浓度的CaCl2溶液分别制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞,在转化过程中用不同的温度进行热激处理,统计分析阳性转化子个数,明确了采用冻融法将外源DNA导入农杆菌EHA105时的几个影响因素的参数。结果表明,当0D。值在1．0—1．5之间时,根癌农杆菌EHA105正处在对数生长期,活力最强;制备感受态细胞时,CaCl2溶液的浓度在6～10mmol·L-1之间,无显著差异,但以10mmol·L-1效果最佳,转化率达5．322×10^6·μg-1热激处理温度在20～37℃之间均无显著差异,但37℃处理时转化率最高,达5．550×10^6·μg-1。     

油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系的建立

以油棕试管苗幼嫩叶片(发芽后25 d)为材料,建立油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系。取幼嫩油棕叶片在30 g/L纤维素酶和8 g/L离析酶的作用下,酶解3.5 h后,2 000 r/min、4℃离心5 min得到油棕叶肉原生质体。借助绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白双质粒瞬时共转化,对油棕叶肉原生质体瞬时体系的相关参数进行优化,结果显示:当瞬时转化过程中质粒含量比为8∶1,PEG/Mg²⁺溶液中PEG4000的质量浓度为200 g/L、Mg²⁺溶液质量浓度为100 g/L,热激20 min,再经过20 min室温孵育,最后加入的洗液体积为2 mL时,原生质体的转化效率最高。     

不同条件对大肠杆菌K12转化质粒pKD46效率研究

研究了不同处理方法、不同生长时期以及热激时间等因素对Escherichia coli K12转化质粒pKD46效率的影响。结果表明,在OD600为0.43时,利用RbCl法制备的新鲜感受态细胞,在42℃热激90s时,对质粒pKD46的转化效率最高,可达到5.4×106。同时,优化了其他影响转化效率的因素。     

阿维链霉菌原生质体制备方法的研究

对阿维链霉菌原生质体制备进行了研究,结果表明:阿维链霉菌原生质体制备的最佳条件为在35 mL含0.5%甘氨酸的YEME培养基中接种孢子悬液,28℃、200 r/min培养40 h;3 000 r/min收集菌丝体,用10.3%蔗糖溶液清洗2次;溶菌酶浓度为4mg/mL的P缓冲液悬浮菌丝体,30℃下处理50 min完成原生质体制备。以50%PEG1000为促融剂,原生质体融合率最高。     

利用废酸奶生产饲料活菌制剂

采用离心-冷冻干燥组合工艺,比较了不同工艺条件下废酸奶的脱水效果和菌种存活率,及载体种类和添加比例对成品状态和含水率的影响。结果表明：废酸奶经4 000 r/min 离心30 min 预浓缩后,添加质量比为10%的麦芽糊精作为载体,冷冻干燥7 h,可以得到含水率低于4.5%,活菌数7*107~6*108 CFU/g 冻干品的饲料活菌制剂,在0℃的贮存条件下袁普通包装可保存268 d袁真空包装可保存1年左右。由以上工艺可制得具有一定市场前景的功能饲料添加剂,其可提高牲畜免疫力,减少抗生素的使用,同时达到节能、减排的目的。