青枯假单胞杆菌产生细菌素的研究

测定来自全国不同寄主和地区的211个青枯病细菌(Pseudomonassolanacearum)菌株产生细菌素的能力,结果表明,有80％分属于不同小种和生物型的8个指示菌能产生细菌素,其中能产生细菌素的桑菌株占其总数的94.2％。 用7个拮抗作用强而稳定的菌株测定对211个供试菌株的拮抗作用,结果表明,不同菌株产生细菌素的能力和拮抗范围有差异。其中油橄榄菌株(OE-104)和桑菌株(MA-1、MA-701)拮抗能力最强,拮抗范围最广。不同小种、生物型及寄主来源的菌株间的桔抗作用大于来源相同菌株间的拮抗作用。此外,试验证明培养温度、培养基成分和培养时间对菌株产生抑制圈的大小有影响。这些结果对筛选青枯病细菌的产细菌素拮抗菌有参考价值。     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.     

假单胞杆菌PsJN DNA芯片的制备及检测

提取假单胞杆菌PsJN总DNA经酶切后,与载体质粒Puc18链接,并转化E. coli DH 5α,从而构成假单胞杆菌PsJN的基因文库.用PCR方法扩增基因文库,所得PCR产物点于芯片上,从而制备PsJN DNA芯片.分别提取不同C源培养的PsJN的总RNA,把不同C源培养的PsJN的总RNA反转录为DNA,用Cy3,CY5分别标记反转录的DNA.通过杂交检测芯片,并获得杂交图像.     

青枯假单胞杆菌运动性的分子研究技术

通过检测,从１０７株野生型青枯假单胞杆菌菌株中获得３０株具有明显运动性的野生型菌株。运用分子技术克隆到控制运动性的基因,并将控制运动性的基因导入不同菌株,从而获得运动性不同的各种工程菌株。运用这些工程菌株进行趋向性和致病性测定,初步试验表明,有运动性的野生型青枯假单胞杆菌菌株具有比非运动性的野生型青枯假单胞杆菌菌株更强的趋向性和致病性。     

铜绿假单胞菌脂肪酶基因(LipA)在枯草芽孢杆菌pab02中的整合表达

对铜绿假单胞菌脂肪酶基因(Lip A)进行克隆,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并在枯草芽孢杆菌pab02中整合表达。根据铜绿假单胞菌Lip A基因设计引物,扩增Lip A基因,并进行测序,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,转化枯草芽孢杆菌pab02,并对转化后的阳性菌株进行诱导表达。结果显示,成功从铜绿假单胞菌A05菌株中扩增到长1 092 bp的Lip A基因,该基因与铜绿假单胞菌Lip A基因(登录号为AB290342)的同源性高达98%;该基因共编码311个氨基酸(aa),包含26个aa组成的信号肽和285个aa组成的成熟肽;成功构建了整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并将Lip A整合到枯草芽孢杆菌pab02染色体上,获得了重组枯草芽孢杆菌pab02–lip A;SDS–PAGE分析结果表明,脂肪酶蛋白得到了有效表达,该蛋白的相对分子质量约为37 000。     

假单胞杆菌BS1培养条件的研究

为了明确假单胞杆菌BS1的适宜培养条件,采用单因素筛选方案对其最适碳源、接种量、温度、pH值、盐浓度和培养基装液量进行研究,发现假单胞杆菌BS1生长的最佳碳源为液体石蜡,生长最适接种量为3%,温度30℃,pH 7.0,NaCl浓度0%,250 mL三角瓶中培养基装量为130 mL。在此优化的培养条件下,假单胞杆菌BS1生长曲线是0~48 h为菌体生长延滞期,48~156 h为菌体快速生长繁殖期,156~240 h为菌体生长稳定期,240 h后为菌体衰亡期。通过对假单胞杆菌BS1的最佳培养条件研究,将为工业化生产提供技术参数。     

蘑菇线虫与假单胞杆菌对食用菌的致病性研究

蘑菇滑刃线虫(Aphelenchoides composticola)不直接危害平菇,能危害蘑菇、香菇、黑木耳,与蘑菇假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)混合接种后危害加重.杆形线虫Rhabditida spp.不危害蘑菇、香菇、黑木耳、平菇,与蘑菇假单胞杆菌混合接种后,蘑菇、香菇、黑木耳表现严重受害症状,平菇则不受其危害.蘑菇假单胞杆菌不危害平菇,只危害蘑菇、香菇和黑木耳.A.composticola,R.spp.P.spp.均对镰刀菌Fusarium osysporum 有破坏作用.A.composticola 在pH 6～7内经48h 死亡率为25%～35%,pH9～12死亡率达80%～100%.R.spp.在pH5以下的范围内均不能生存,在pH8～12死亡率均较低.P.spp.在pH3～12范围均能生长.     

谷关假单胞菌脂肪酶基因PgLip1的克隆和表达

低温脂肪酶在饲料、洗涤、有机合成等行业中具有重要的应用价值,然而目前已发现的低温脂肪酶数量不多,对其基因多样性了解不够深入,因此有必要从自然环境中挖掘新的低温脂肪酶基因。为了获得低温脂肪酶基因资源,通过基因组序列比对分析,从谷关假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）中发现并克隆获得一个脂肪酶基因P. guguanensis lipase 1 (PgLip1),并对该基因进行序列分析和蛋白质预测,表达后检测PgLip1的最适底物、最适pH、最适温度,同时研究了表面活性剂、变性剂、EDTA、金属离子及有机溶剂对该酶活性的影响。结果显示：该基因片段大小为840 bp,预测编码含279个氨基酸残基的蛋白质,氨基酸序列与来源于门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）的脂肪酶相似性92.6%。该酶的最适温度为10 ℃,在0 ℃相对酶活为60.2%,是一个低温脂肪酶;其最适pH为8.5,在pH 3.0~12.0时,仍然具有62%以上的相对酶活。40 ℃处理45 min后,PgLip1还能保持72.6%的残余酶活。该酶的最适反应底物为对硝基苯基丁酸酯(pNPB);在高浓度异丙醇、异戊醇和乙酸乙酯中的酶活反而高于相应较低浓度中,吐温-20、吐温-80和Triton X-100表面活性剂能较大程度激活PgLip1（3.2~5.9倍）。研究丰富了对低温脂肪酶生物多样性的科学认识,所获得的PgLip1是一个受表面活性剂特异激活且对部分高浓度有机溶剂耐受的低温脂肪酶,具有较好的应用前景。     

嗜铁假单胞杆菌C-12产嗜铁素的影响因素

为进一步开发利用假单胞菌C-12,试验采用光谱吸收法,对来自土壤中的1株假单胞菌C-12产生嗜铁素的条件进行研究.结果表明:在416 nm处有1个嗜铁素特异吸收峰,当铁离子浓度为1 μmol/L时,最适合其产嗜铁素.不同培养条件对嗜铁菌假单胞菌分泌嗜铁素有明显影响.适合C-12分泌嗜铁素的最佳条件为培养基为MSA培养基,最适培养温度为32℃,以脯氨酸为氮源、蔗糖为碳源,C/N为3∶1,pH6.0.     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因cDNA的克隆及表达分析

根据已知鱼类抗菌肽hepcidin的同源性设计简并引物,利用同源克隆结合RACE法从黄鳝(Monopterus albus)肝脏中扩增得到了黄鳝hepcidin基因全长cDNA序列(GenBank accession number FJ436808).结果表明,黄鳝hepcidin基因cDNA全长712 bp,5′端非翻译区有133 bp,3′端非翻译区有306 bp,包含1个273 bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽.同源性分析表明,黄鳝hepcidin推测的氨基酸序列与其他鱼类报道的hepcidin具有较高的同源性,并具有8个半胱氨酸这一典型特征,是hepcidin家族的1个新成员.采用半定量PCR法对该基因在健康成体不同组织的转录本和脂多糖(LPS)对该基因表达的影响进行了分析.结果发现,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24 h后,各组织的hepcidin基因表达量都有明显升高.     

梨磷脂酰胆碱转移蛋白基因的克隆及其表达分析

据转录组测序结果,结合RACE(cDNA末端快速扩增技术)和Genome walking(染色体步移技术)获得了梨磷脂酰胆碱转移蛋白基因的完整读码框序列,其开放阅读框长为1 323 bp,编码的440个氨基酸序列与葡萄磷脂酰胆碱转移蛋白质的同源相似性达73%,其具有START domain(启动域)、ZnF_TAZ(TAZ锌指结构)、DCD(双氰胺)保守结构域,将梨磷脂酰胆碱转移蛋白基因命名为PePCTP1。PePCTP1基因与GFP融合,构建植物表达载体,洋葱表皮亚细胞定位观察结果显示,PePCTP1基因编码的蛋白质分布在细胞膜上。用激素生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(6-BA)及NaCl诱导处理,发现与对照(CK)相比,SA和GA处理后PePCTP1基因表达量显著上升;NaCl和IAA处理后PePCTP1基因的表达量随时间逐渐上升;而ABA和6-BA处理不能增加目的基因的表达量。据此推测PePCTP1可能参与梨的逆境胁迫抗性反应。     

青蒿高产株系001法呢基焦磷酸合酶基因的克隆、原核表达及酶活性测定

法呢基焦磷酸合酶(FPS)是治疗疟疾的特效药物——青蒿素生物合成途径的关键酶。运用RT-PCR方法从青蒿高产株系001中克隆法呢基焦磷酸合酶基因;构建His标签融合蛋白FPS表达载体,进行原核诱导表达、蛋白纯化及酶活性测定的研究。结果表明:克隆的FPS基因和文献已报道的2个青蒿FPS基因编码的氨基酸序列的同源性分别为98.83%和99.42%;原核诱导表达的His标签融合蛋白FPS的表达量高、可溶性好,具有FPS酶活性。     

耐盐杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究利用RT-PCR技术,克隆出编码杜梨PP2C蛋白的基因Pb PP2C,其核苷酸序列全长1 353 bp,开放阅读框长1 263 bp,编码422个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与拟南芥AHG3亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中的表达12 h达到峰值,同时在根中72 h达到第二个峰值;干旱胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中表达72 h达到峰值。说明Pb PP2C与杜梨耐盐和耐干旱胁迫存在紧密关联。     

冷却猪肉中假单胞菌生长预测模型的建立与验证

以从腐败猪肉中分离得到的假单胞菌P1,P2,P3,P4,P5,P6的混合培养物为受试菌液,应用Origin7．5软件拟合假单胞菌0-10℃下的生长情况。经比较发现,修正的Gompertz模型对假单胞菌生长曲线的拟合效果优于线性模型,R2均在0．96以上。应用平方根模型和Arrhenius模型对由修正的Gompertz模型得出的最大比生长速率进行拟合,所得Arrhenius模型的R2为0．9716,拟合效果优于平方根模型（R2为0．9326）。结果表明,所建二级模型,能真实快速有效地预测0-10℃冷藏条件下假单胞菌的生长。     

烟草花叶病毒蚕豆分离物移动蛋白基因克隆及序列分析

根据已报道的ＴＭＶ Ｕ１株系（ＴＭＶ－Ｕ１）的序列设计了特异性引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从烟 草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ）上扩增移动蛋白（ＭＰ）基因及其邻近序列。将此ｃＤＮＡ片段克隆于 ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质粒上,进行测序分析。结果表明：ＭＰ基因由８０７个核苷酸组成,编码２６８个氨基酸。与 ＴＭＶ－Ｕ１的ＭＰ基因序列比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为９９．０１％和 ９８．８９％。与ＴＭＶ－Ｙｕ的ＭＰ基因序列比较,同源性分别为９８．１４％和９８．８９％。说明ＴＭＶ的ＭＰ基因 在不同株系中是非常保守的。     

荧光假单胞菌CZ对TMV的抑制作用及其活性蛋白的分离纯化

从烟草根际中分离到一株拮抗烟草花叶病毒(TMV)的生防菌荧光假单胞菌CZ,将其发酵液接种或喷施TMV寄主三生NN烟后进行生物学检测.结果表明:荧光假单胞菌CZ发酵液与TMV混合后接种,其枯斑抑制率为91.5％;接种TMV的前、后24h喷施CZ发酵液,对TMV的抑制率分别为78.9％和30.5％.荧光假单胞菌CZ发酵液经硫酸铵盐析获得活性粗蛋白,经阴离子层析、superdex-G-75凝胶层析和SDS- PAGE检测,分子量为39.4 kD.     

棉花P-typeATPases基因的克隆及表达分析

为了探明棉花P-type ATPases基因在植物不同组织和多种逆境条件下的表达情况,利用棉花黄萎病菌的P-type ATPases蛋白序列,在GenBank中搜索棉花EST序列,得到2个同源的棉花EST片段,结合RACE和Genome walking获得了这个基因的完整读码框序列,其开放阅读框长度为3570bp,编码1190个氨基酸,与毛果杨、蓖麻的同源性达86％左右,将其命名为Gbpatp.洋葱表皮亚细胞定位观察结果显示,Gbpatp编码的蛋白分布在细胞膜上.RT-PCR技术检测组织表达特异性分析表明,P-type ATPases在茎和棉絮中的表达量较高,在种子中低水平表达,在叶片和花蕾中表达量极低,说明Gbpatp可能与棉花较成熟的器官茎、棉絮和种子的生长发育密切相关.在逆境胁迫中发现,干旱处理后Gbpatp的表达强烈,并且随处理时间延长表达量逐渐增加；重金属Cu2+处理24h后Gbpatp表达量升高,但48h急剧下降；Gbpatp在低温处理下也有轻微表达.激素诱导后发现,Gbpatp对赤霉素和脱落酸均有响应,随胁迫时间延长其表达量仍能维持在一定水平.