蜥蜴利什曼原虫在小鼠体内的分布及增殖研究

通过腹腔途径用体内含有荧光蛋白的蜥蜴利什曼原虫感染BALB/c小鼠,感染后采其脏器做冰冻切片,荧光染料染色后用荧光显微镜观察,并经PCR鉴定,结果显示蜥蜴利什曼原虫感染小鼠后,主要分布于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏。另外,成功建立了利什曼原虫荧光定量PCR检测方法,并采用该方法检测感染蜥蜴利什曼原虫后BALB/c小鼠体内利什曼原虫的增殖情况,结果显示,感染13 d内,BALB/c小鼠体内蜥蜴利什曼原虫呈波浪状增殖。这一结果为研究蜥蜴利什曼原虫感染人和动物的致病机理和免疫方法及疫苗研制等方面提供了基础理论依据。     

锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据锦鲤疱疹病毒(KHV)胸苷激酶(TK)基因的保守序列设计一对引物和相应的TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,用于锦鲤疱疹病毒快速、灵敏、可定量的检测手段。构建并制备实时荧光定量PCR的标准品,对反应体系进行优化,并做特异性,敏感性和重复性试验。结果表明,成功构建荧光定量PCR标准品,建立荧光定量标准曲线,标准曲线的相关系数为0.992,所建立的荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,重复性好。     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

禽流感DNA疫苗重组质粒组织分布的实时荧光定量PCR方法建立

为研究禽流感病毒(AIV)DNA疫苗重组质粒在组织中的分布情况,本研究以AIV DNA疫苗pCAGGoptiHA 5HA基因为检测对象,分别建立检测AIV DNA疫苗重组质粒的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法和TaqMan MGB实时定量PCR方法。经优化比较两种方法的特异性、敏感性、重复性和污染率。结果表明,两种方法的标准曲线线性关系均较好,相关系数均达到0.999;最低检测量为42 copies,特异性强;探针法的重复性优于染料法,污染率低于染料法,因此采用TaqMan MGB实时定量PCR方法检测AIV DNA疫苗重组质粒组织分布情况。     

猪星状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计了1对引物，分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板，采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体，确定特异性产物的Tm值，同时做普通PCR。试验结果表明，特异性产物的Tm值为88．5℃，最低能检测到含0．036fg／μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化，建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性，为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测鉴定狮制品

为建立SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定狮（Panthera Leo）制品的方法,本文在豹属动物线粒体细胞色素b基因上设计狮特异性引物,建立并优化了SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定体系,采用17种血液、组织和骨粉类样品的DNA,通过扩增曲线和融解曲线分析检测的特异性和灵敏度,并用狮肉粉和牛肉骨粉系列百分比混合物进行抗干扰能力分析。结果显示,狮血液和组织DNA样品均出现特异性的实时扩增曲线,平均熔解温度在84±0.2℃。虎、豹、熊等14种哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。灵敏度检测显示,本实验所建立的SYBRGreen I实时荧光PCR方法能够检测出10 pg/μL的狮组分DNA。抗干扰能力显示在骨粉中狮的成分最低检出含量为0.1%。这些结果说明,本文建立的SYBR Green I实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性,可用于狮源性制品的检测鉴定。     

鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立

[目的]建立准确、快速检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的方法。[方法]以BCSP31作为布鲁菌菌属特异性基因,以IS711插入元件作为布鲁菌菌种特异性标志,设计引物和Taqman探针;分别构建标准阳性质粒模板,将其10倍倍比稀释作多重实时荧光定量PCR标准曲线,评价多重实时荧光定量PCR反应体系的敏感性、特异性、重复性。[结果]建立了鉴别牛种、羊种布鲁菌的实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床样品进行检测。[结论]所建立的多重实时荧光定量PCR诊断方法能够快速、准确地鉴别牛种和羊种布鲁菌。     

转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

根据转基因低木质素苜蓿草品系KK179-2 5’端外源插入序列与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立了KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对其特异性、灵敏度及可重复性进行了测定。结果表明:建立的定量实时荧光PCR检测方法特异性良好;标准曲线线性相关系数(R~2)为0.99,扩增效率E为105%;检测限为20拷贝,定量限为200拷贝。重复性实验显示本方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内。综上,建立的KK179-2品系特异性定量PCR检测方法适于快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草KK179-2品系进行检测。     

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的建立

依据非洲猪瘟病毒(ASFV)的vp73基因保守序列,设计了特异性引物与TaqMan探针,扩增片段69bp,建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对,结果显示,本文建立的方法与OIE两种检测方法的特异性相当,灵敏度与OIE荧光PCR方法相当,但比普通PCR方法高出至少10倍。标准定量曲线显示,本文方法最低检测限可达10 copies/μL病毒DNA(相关系数为0.993046)。重复性试验的批内CV值为0.61%～1.14%,批间CV值为1.37%～3.14%,表明本文方法的重复性和稳定性良好。可见,本文建立的基于vp73基因的ASFV实时荧光PCR检测方法具备快速、准确、灵敏的特点,将为检验检疫部门防御ASFV传入我国提供更多技术支持。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SYBR-Green实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。     

水牛体外培养早期胚胎中致密化相关基因mRNA的表达分析

为了研究致密化相关基因在水牛体外培养早期胚胎中的mRNA表达情况,采用Taqman探针法和SYBR GreenⅠ染料法分别分析了缝隙连结蛋白43和31(Cx43、Cx31)、上皮钙调素蛋白(E-cad)3个基因在水牛体外成熟卵母细胞及培养的早期胚胎中的mRNA表达。结果发现,Cx43基因在水牛成熟卵母细胞中表达量最高,显著高于后3个发育阶段(P0.05);Cx31基因mRNA表达趋势与Cx43相反,成熟卵母细胞中表达量最低,囊胚期最高,随体外胚胎发育Cx31mRNA表达量逐渐增高;E-cad基因在体外培养的各阶段胚胎中mRNA表达无显著差异(P0.05)。以上结果表明,3个致密化相关基因在水牛体外培养早期胚胎中均有表达,但是具有明显不同的mRNA表达方式。     

荧光定量PCR检测牛性别相关基因DAX1表达的标准质粒和标准曲线的构建

本研究根据GenBank中登录的剂量敏感的性别反转－先天性肾上腺发育不良基因1(dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1,DAX1)设计引物,构建包含DAX1基因cDNA片段的质粒,作为中国荷斯坦牛DAX1基因mRNA定量检测的标准品,建立了DAX1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～106拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值间有着良好的线性关系(r=0.99975),扩增效率高(E=100%),可以作为检测牛DAX1基因mRNA定量检测方法。     

猪伪狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒（PRV）gE基因的序列（EF552427）,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9999,最低检测的拷贝数为35.4拷贝/25μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点。本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。     

布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针,建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品,进行实时定量荧光PCR反应检测,通过优化反应条件,建立标准曲线。以标准品为模板,对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析,结果表明,该检测体系的检测灵敏度高,重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌,具有良好的应用前景和市场价值。     

猪IL-2、IL-12p40和IFN-γ SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

针对猪Th1型细胞因子IL-2、IL-12p40、IFN-γ以及管家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-2、IL-12p40、IFN-γ及β-actin的SYBR Green I real-time PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到100拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3.5%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中IL-2、IL-12p40和IFN-γ mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,所建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。     

牛副结核分枝杆菌实时荧光定量 PCR 检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因保守区域序列设计合成1对特异性引物,建立了一套SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测牛副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)的方法。以实验室构建的牛副结核分枝杆菌pMD-ISMav2阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线,其相关系数为0.999。以构建的标准品为模板,进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法检测布氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌DNA均为阴性;最低可检测到相当于每微升1.96×10¹拷贝数的标准品阳性质粒。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感和快速等优点,可用于牛副结核杆菌病的监测。     

牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。