藏绵羊MHC-DRB1基因第3外显子的PCR-SSCP检测及其序列分析

为了研究藏绵羊DRB1基因第3外显子多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、变异类型和各等位基因间的遗传关系,本研究采用PCR-SSCP方法,分析了500只藏绵羊(Ovis aries)DRB1基因第3外显子多态性,并对不同等位基因进行克隆和测序。结果表明,藏绵羊DRB1基因第3外显子表现了8个等位基因,8个单倍型序列分析发现了15个核苷酸多态位点,与GenBank序列对比分析,有7个DRB1的等位基因是首次发现。8个DRB1第3外显子的单倍型序列NJ系统发育树呈2支分化趋势。3个种群藏绵羊中B均为优势等位基因,该位点PIC>0.5,为高度多态且显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。研究认为,藏绵羊DRB1基因第3外显子具有丰富的多态性;藏绵羊DRB1基因最初是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因。     

绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性分析

促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)在光周期介导的哺乳动物季节性繁殖过程中起着非常重要的作用,但在绵羊(Ovis aries)中的遗传特性与分子机制仍不明晰.本研究以筛选的绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点SNP为候选分子标记,利用多聚酶链式反应-单链构象多态(polymerase chain reaction-single strand conformation polymerase,PCR-SSCP)技术,检测该位点在繁殖特性不同的阿勒泰羊、中国美利奴羊、萨福克羊、多浪羊以及湖羊和小尾寒羊群体中的多态性.结果表明,绵羊TSHR基因在第10外显子481 bp处发生了T-C突变,为同义突变,SSCP检测出3种基因型:TT、TC和CC,T481C位点的TT基因型在常年发情的湖羊、小尾寒羊和多浪羊群体中属于优势基因型,而在季节性繁殖的阿勒泰羊、萨福克羊和中国美利奴羊群体中比率最低,仅为8％;方差分析结果表明,常年发情的多浪羊、小尾寒羊和湖羊群体T481C位点的基因型频率与季节性繁殖的阿勒泰羊、萨福克羊和中国美利奴羊存在极显著差异(P＜0.01).研究结果提示,绵羊TSHR基因第10外显子T481C位点多态性在常年发情与季节性繁殖绵羊群体中分布存在较大差异,该SNP可作为一个理想的分子标记应用于常年发情绵羊品种选育.     

蒙古牛MHC—DRB3和DQB基因的PCR—RFLP多态性分析

采用限制性内切酶BstYI,HaeⅢ和TaqⅠ,RsaⅠ,HaeⅢ分别对蒙古牛BoLA-DRB3基因和DQB基因的第二外显子的PCR产物进行消化，结果表明二者均为多碱基突变；x^2适合性检验结果表明蒙古牛BoLA-DRB3的第二外显子的第70，182位的碱基以及DQB基因的第二外显子的第24，38，74，108，122，138，177位的碱基已经达到了Hardy-Weinberg平衡状态。     

牛BoLA-DRB3基因第2外显子多态性及其序列分析

BoLA-DRB3基因是牛主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)基因家族中的Ⅱ类基因,它是该基因家族中最主要的功能基因,所编码的MHC抗原与免疫应答和抗病性密切相关。其第2外显子编码抗原的主要功能区。实验采用PCR-RFLP方法对鲁西牛、南阳牛和晋南牛3个群体的BoLA-DRB3基因第2外显子扩增产物进行多态性分析,检测到A、B和C3个等位基因,出现6种基因型。χ2适合性检验结果表明,鲁西牛和晋南牛在HaeⅢ酶切位点均达到了Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而南阳牛未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)。结合测序,结果显示在BoLA-DRB3基因第2外显子的第154、155、156和157位的碱基产生突变使得产生HaeⅢ酶切多态。序列比对后发现有13.70%的核苷酸发生突变,相对应有14.61%的氨基酸发生了替代。     

绵羊MXD3基因的生物信息学分析

MAX二聚化蛋白3(MAX dimerization protein 3, MXD3)在肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移过程中起重要作用,广泛存在于多种动物体内。为探究MXD3基因在绵羊体内的功能,运用生物信息学数据库及其软件,分析了该基因及其编码的产物。结果发现,绵羊MXD3基因总共编码了206个氨基酸残基,所编码的蛋白质分子式为C1000H1650N332O315S6,分子质量为23 556.50 KDa,理论等电点pI为9.32,半衰期为30 h,不稳定指数为88.30。通过基本理化性质分析可知,绵羊MXD3主要在细胞核发挥作用,不属于分泌蛋白,不存在信号肽序列,不存在跨膜结构,是亲水性蛋白。该蛋白的二级结构主要是以无规卷曲、α螺旋组成,而三级结构预测结果与二级结构相符。     

藏绵羊DQA座位基因的适应性进化研究

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是脊椎动物重要的功能基因家族之一,其所编码的MHC分子具有维持机体世代适应环境变化的能力和功能,是研究动物适应性进化研究的最佳遗传标记.本研究选择青藏高原的主要畜种资源——藏绵羊(Ovis aries)为研究对象,利用聚合酶链式反应-单链构象多态(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)技术对甘肃(欧拉,乔科和甘加型)和青海(青海欧拉型和青海高原型)的5个藏绵羊生态群体的DQA座位基因遗传特征进行研究,以期揭示其与藏绵羊高原适应性进化的机制;结果在藏绵羊DQA座位的2个基因中发现了33个等位基因和125个核苷酸变异位点,表明5个生态群体藏绵羊的DQA座位基因均具有丰富的多态性;分析证明平衡选择是维持藏绵羊DQA座位基因多态性的主要机制之一,甘肃和青海5个藏绵羊生态群体DQA座位基因区域之间的变化(among groups)小于同一区域不同群体间的变化(among population with groups),进一步说明藏绵羊DQA座位基因发生了正选择作用和适应性进化.研究结果将为藏绵羊的遗传改良和种质创新提供基础数据.     

牛亚科MHC DRB3基因exon2的序列变异分析

根据牛（Bos taurus）主要组织相容复合体（MHC）DRB3基因的已知序列设计引物，对中国牦牛（B．grunniens）的DRB3基因exon2进行扩增和克隆测序，并根据DRB3基因exon2序列对牛亚科的遗传多样性和分子系统发育进行了分析。结果在234的片段中发现有115个多态位点，多态位点百分率为49．15％。由标准遗传距离和净遗传距离构建的牛亚科系统发育树，可将牛亚科分为5个属，支持将牦牛作为牛亚科中一个独立的属的观点。多态性较丰富的DRB3基因exon2适于属间系统发育分析。     

苏太猪SLA-DQB及DRB基因第2外显子多态性及其与繁殖性能的关联分析

采用PCR-RFLP技术对苏太猪SLA-DQB及DRB基因第2外显子PCR产物进行分析，结果表明：苏太猪SLA-DQB基因经RsaⅠ酶切后共产生3种等位基因，5种基因型；SLA-DRB基因经RsaⅠ酶切后共产生3种等位基因，4种基因型。χ2适合性检验表明，苏太猪SLA-DQB及DRB基因外显子2的RsaⅠ酶切位点均达到了Hardy-Weinberg平衡状态。将SLA-DQB和DRB基因的基因型进行组合，共产生12种组合基因型，BBDF的第3胎繁殖性能总产仔数、产活仔数、初生窝重和断奶仔猪数显著高于组合基因型AADD、AADF、ABDD和CCDF（P＜0.05）。就繁殖性能而言，BBDF在群体中为最优秀的组合基因型。     

绵羊骨形态发生蛋白受体IB基因部分3′非翻译区的多态性分析

根据绵羊骨形态发生蛋白受体IB（bone morphogenetic protein receptor IB, BMPR-IB）基因部分调控区的mRNA序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因部分3′非翻译区序列在4个绵羊品种（小尾寒羊、湖羊、特克塞尔和中国美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性。结果发现引物P1扩增片段存在多态性,其余2对引物的扩增片段均不存在多态性。对于引物P1,只在湖羊中发现AA和BB两种基因型,其余3个品种均为AA型。测序表明BB型与AA型相比有2个碱基突变（121T→C和195T→C）。     

绵羊骨形态发生蛋白受体IB（BMPR-IB）基因部分3′非翻译区的多态性分析

根据绵羊骨形态发生蛋白受体IB（bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB）基因部分调控区的mRNA序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因部分3′非翻译区序列在绵羊（Ovis aries）高繁殖力品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力品种（特克塞尔和中国美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊和湖羊高繁殖力的影响。结果发现,引物P1扩增片段存在多态性,其余2对引物的扩增片段均不存在多态性。对于引物P1,只在湖羊中发现AA和BB两种基因型,其余3个品种均为AA型;测序表明BB型与AA型相比有2个碱基突变（121T→C和195T→C）;湖羊AA和BB基因型频率分别为0.575和0.425,湖羊AA和BB基因型之间产羔数的最小二乘均值差异不显著（P〉0.05）。研究结果初步表明,检测的BMPR-IB基因位点对小尾寒羊和湖羊高繁殖力都没有显著影响。     

绵羊抑制素βA基因多态性及其与产羔数关系的研究

设计7对引物,采用PCR-SSCP技术检测抑制素βA亚基(inhibin βA,INHBA)基因在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊和湖羊)和低繁殖力绵羊品种(多赛特羊、特克塞尔羊和德国肉用美利奴羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊产羔数的影响。结果发现引物1-2、2-2和2-4扩增片段有多态性,其余4对引物的扩增片段均不存在多态性。引物1-2,多赛特羊只出现BB基因型,而其余4个绵羊品种则出现AA、AB和BB基因型;测序结果表明,BB型和AA型相比在INHBA基因5'端调控区第50位碱基处发生1处突变(G→A),该突变没有导致氨基酸的改变;小尾寒羊AA、AB和BB基因型之间产羔数的最小二乘均值差异都不显著(P>0.05)。引物2-2,多赛特羊和德国肉用美利奴羊出现GG、GH和HH基因型,而其余3个绵羊品种只出现GG基因型;测序结果表明HH型和GG型相比在INHBA基因外显子2第142位碱基处发生1处突变(C→T),该突变导致了氨基酸由丝氨酸改变为亮氨酸。引物2-4,德国肉用美利奴羊只出现KK和KL基因型,而其余4个绵羊品种则出现KK、KL和LL基因型;测序结果表明LL型和KK型相比在INHBA基因外显子2第95位碱基处发生1处突变(G→A),该突变没有导致氨基酸的改变;小尾寒羊KK、KL和LL基因型之间产羔数的最小二乘均值差异均不显著(P>0.05)。研究结果初步表明,检测的INHBA基因位点对小尾寒羊高繁殖力没有显著影响。     

催乳素基因多态性及其与小尾寒羊高繁殖力关系的研究

设计5对引物，采用PCR-SSCP技术检测催乳素（prolactin，PRL）基因外显子1至外显子5在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（多赛特、特克塞尔和考力代）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。通过克隆测序首次获得了绵羊PRL基因外显子全序列。结果表明：外显子2在5个绵羊品种中均存在单核苷酸多态性，而其它4个外显子只在湖羊中存在单核苷酸多态性。本研究初步表明小尾寒羊PRL基因外显子2的CC型平均产羔数分别比CD型和DD型多0.39只（P<0.05）和0.98只（P<0.05），CD型和DD型小尾寒羊平均产羔数差异不显著（P>0.05）。     

草原红牛及其杂种后代A-FABP第4外显子遗传多态性分析

本研究选取没有亲缘关系、月龄相同、并在同一条件下饲养的草原红牛个体78头,草原红牛与利木赞第一代杂交后裔128头进行颈静脉采血提取基因组DNA,并利用PCR-SSCP技术对其肉质性状相关的A-FABP基因第4外显子进行遗传检测分析。研究结果表明,草原红牛A-FABP基因第4外显子区域表现AA、BB和AB共3种基因型,其基因型频率分别为0.59、0.04和0.37;基因频率分别为0.61、0.39;多态信息含量(PIC)为0.37,杂合度(He)为0.48,属于中度变异。草原红牛与利木赞牛杂交后代群体也检测到2个等位基因、3种基因型,基因型频率分别为0.23、0.58和0.19;等位基因频率为0.52、0.48;PIC为0.38,He为0.50。据本研究结果可知草原红牛及杂交后代群体遗传变异较大、具有一定选择潜力,能够较好利用分子遗传标记手段指导育种。     

山羊促黄体素受体基因（LHR）外显子11的PCR-SSCP分析

设计6对引物,用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和序列分析方法检测促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)基因外显子11在性早熟、高繁殖力山羊(Capra hircus)品种(济宁青山羊)和性晚熟、低繁殖力品种(波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊性早熟和高繁殖力的影响.结果发现,仅引物P3和P6的扩增片段具有多态性.引物P3在波尔山羊中检测到AA、AB和BB基因型,在济宁青山羊和安哥拉山羊中均检测到AA和AB基因型,在内蒙古绒山羊中只检测到AA基因型;测序发现BB基因型与AA基因型相比存在1个突变(G1522A),导致505位氨基酸南缬氨酸变为甲硫氨酸(V505M);济宁青山羊从和AB基因型频率分别为0.919和0.081,在P3位点上处于哈迪-温伯格平衡状态(,P=0.877);济宁青山羊与波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊之间LHR基因型分布差异分别达到极显著(P<0.001)、显著(P<0.05)和不显著(P>0.05)水平;济宁青山羊AA和AB基因型之间产羔数差异不显著(P>0.05).引物P6在4个山羊品种中均检测到CC和CD基因型;测序发现CD与CC基因型相比发生了A2039G突变,导致677位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸(Q677R);济宁青山羊CC和CD基因型频率分别为0.161和0.839,在P6位点上处于哈迪-温伯格不平衡状态(,P=0.000);济宁青山羊与波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊之间LHR基因型分布差异分别达到极显著(P<0.001)、极显著(P<0.001)和显著(P<0.05)水平;济宁青山羊CC和CD基因型之间产羔数差异不显著(P>0.05).研究结果初步表明LHR基闪外显子11对济宁青山羊的性早熟和高繁殖力没有显著影响.     

小尾寒羊BMP15基因多态性及其与高繁殖力关系的研究

以控制Belclare、Cambridge、Hanna、Inverdale和Lacaune绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15基因(bonemorpho-geneticprotein15,BMP15)为候选基因,根据绵羊BMP15基因全序列设计6对引物覆盖全部的外显子,采用PCR-SSCP方法检测BMP15基因在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊)和低繁殖力绵羊品种(多赛特羊)中的多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明,只有外显子1的第1对引物扩增片段具有多态性,其余5对引物扩增片段都没有多态性。在127只小尾寒羊母羊和30只多赛特母羊中都检测到两种基因型(AA和AB)。统计结果表明,小尾寒羊和多赛特羊AA基因型频率分别为0.638和0.800,AB基因型频率分别为0.362和0.200。测序结果表明,AB基因型和AA基因型相比在cDNA第28bp处缺失了3个碱基(CTT),小尾寒羊和多赛特绵羊都发生了与Belclare、Cambridge、Hanna和Inverdale绵羊相同的CTT缺失突变。AB基因型小尾寒羊平均产羔数比AA基因型多0.20只,但差异不显著(P>0.05)。研究结果提示,BMP15基因的CTT缺失突变对小尾寒羊高繁殖力没有显著影响。     

小尾寒羊高繁殖力候选基因INHA的研究

采用PCR-SSCP技术检测抑制素α(inhibin α,INHA)基因5'调控区和外显子1在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊)以及低繁殖力绵羊品种(中国美利奴绵羊、考力代绵羊和南非肉用美利奴绵羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。小尾寒羊、中国美利奴绵羊和考力代绵羊在INHA基因5'调控区发生了1处碱基突变(316C→T),南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变;突变纯合型(BB)和突变杂合型(AB)小尾寒羊平均产羔数分别比野生型(AA)多1.45只(P<0.01)和0.90只(P<0.01)。小尾寒羊和考力代绵羊在INHA基因外显子1中发生了1处碱基突变(877T→C),中国美利奴绵羊和南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变;突变纯合型(DD)和突变杂合型(CD)小尾寒羊平均产羔数分别比野生型(CC)多1.32只(P<0.01)和0.77只(P<0.01)。研究结果初步表明INHA基因可能是影响小尾寒羊高繁殖力的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个分子标记。     

兴义鸭LPL基因外显子8多态性与生长和肉质性状的关联性分析

脂蛋白脂酶（LPL）是动物脂质沉积和新陈代谢的关键酶,对生长和肉质发挥着重要作用。试验采用PCR-SSCP法和DNA直接测序技术相结合对兴义鸭LPL基因外显子8进行多态性检测,并分析其多态与生长和肉质性状的关联性。结果表明,在兴义鸭LPL基因外显子8首次检测到1个T1251C同义突变,产生三种基因型TT、TC和CC,2个等位基因T和C,基因型TT和等位基因T的频率分别为0．8077和0．8750,多态信息含量为0．1948,表现为低度多态,卡方（X2）检验表明T1251C位点的基因型分布在兴义鸭中未偏离Hardy-Weinberg平衡。最小二乘分析显示,TT基因型个体的宰前体重显著低于CC基因型（p〈0．05）,胸宽显著低于TC基因型白〈0．05）,推测等位基因C可能是兴义鸭生长性状的有利等位基因,可作为生长性状的一个标记性辅助选择位点。     

山羊雌激素受体(ESR)基因部分外显子多态性分析

雌激素受体(estrogen receptor,ESR)与雌激素专一性地结合,并通过与雌激素的相互作用来调节生殖机能相关基因的表达,在动物繁殖中起着重要作用。研究采用PCR-SSCP和测序方法分析ESR基因外显子1、4在部分山羊(Capra hircus)品种中的单核苷酸多态性,并研究该基因对山羊繁殖力的影响。结果表明：ESR基因外显子1、4在所检测的济宁青山羊、波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中均不存在多态性;山羊扩增片段核苷酸和氨基酸序列与人、牛、猪、马、绵羊、大鼠、小鼠和鸡8个物种的同源性分别为51.3%～97.3%和64.5%～98.3%;山羊ESR基因氨基酸序列存在2处特有突变,分别是外显子1第81位插入一个脯氨酸(P)和外显子4第4位由天冬氨酸突变为天冬酰胺(D4N)。哺乳动物ESR基因外显子1、4序列保守性强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。