紫参薯查尔酮合成酶及异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮合成酶及其异构酶是黄酮类化合物合成途径中的2个关键酶,为研究其在紫参薯花青素合成途径中的功能,利用RT-PCR技术从紫参薯Da56块茎中克隆到查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)和查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因,分别命名为DaCHS和DaCHI。结果表明:DaCHS基因包含825 bp的完整开放阅读框(ORF),预测编码274个氨基酸;DaCHI基因包含663 bp的完整开放阅读框,预测编码221个氨基酸。生物信息学分析结果表明,紫参薯DaCHS与油棕Eg CHS亲缘关系最近,氨基酸相似性达到90%;紫参薯DaCHI与野茶树CaCHI亲缘关系最近,氨基酸相似性达到67%。实时荧光定量PCR检测结果表明,DaCHS和DaCHI基因均具有组织表达特异性,其中DaCHS在花中相对表达量最高,而DaCHI在块茎中相对表达量最高;在紫参薯块茎发育不同时期的表达分析表明,DaCHS、DaCHI均在薯块膨大期相对表达量最高。本研究通过对DaCHS和DaCHI基因全长cDNA序列的克隆与分析,为紫参薯花青素合成途径的遗传调控及花青素形成机理的研究奠定基础。     

马铃薯花青素转录激活基因(stmyc)的克隆及表达分析

花青素(anthocyanin)为糖苷类物质,属于类黄酮色素.在花青素生物合成途径中,调控基因主要编码R2R3-MYB、bHLH和WD40转录因子,共同调控花青素合成的结构基因的表达,进而控制花青素在植物中的时空表达和沉积的模式(Holton and cornish,1995).本研究以紫色马铃薯为材料,克隆花色素合成的转录激活基因stmyc并研究其表达模式,为阐明马铃薯花色素生物合成和沉积机制提供依据.     

橡胶树F3’H基因克隆及其功能分析

从橡胶树叶片转录组数据库中调取花青素合成途径中的关键酶类黄酮3’-羟化酶（F3’H）基因序列信息,通过RT-PCR扩增得到2个橡胶树F3’H基因,分别命名为HbF3’H1和HbF3’H2。通过荧光定量PCR分析发现,只有HbF3’H1基因在不同发育时期的橡胶树叶片和嫩茎中的表达水平与花青素的合成积累趋势完全一致。HbF3’H1所编码的蛋白属于P450超家族,具有保守的F3’H结构域,而且HbF3’H1基因的启动子中包含多种环境效应元件,说明HbF3’H1基因的表达受环境因子调控。通过农杆菌转化烟草发现,过表达HbF3’H1基因的烟草花瓣大量累积花青素,其颜色较非转基因烟草显著加深,同时,荧光定量PCR发现HbF3’H1表达水平与转基因烟草花瓣颜色呈正相关,说明HbF3’H1基因表达促进花青素的累积。本研究为阐明橡胶树花青素代谢途径奠定基础。     

花生AhMYB113异位表达促进烟草花青素积累

为进一步探索MYB转录因子在花生花青素积累过程中的调控机理,以花生常规品种鲁花11（绿色叶片）和紫色叶片花生种质056杂交后代为材料,基于绿色和紫色杂交群体数字基因表达谱克隆了AhMYB113基因,利用生物信息学手段进行保守结构域、系统进化树等分析,通过实时荧光定量PCR技术检测在花生中的表达模式,在转基因烟草中进行功能鉴定。结果表明,花生AhMYB113基因的开放阅读框全长864 bp,编码287个氨基酸残基;编码蛋白的N端包含2个高度保守的MYB结构域,属于R2R3-MYB转录因子;与拟南芥、金鱼草、矮牵牛、苹果、葡萄中调控花青素积累的R2R3-MYB聚成一大类;通过荧光定量PCR分析发现,AhMYB113在花生紫色杂交后代（PH、PS）中的表达水平要显著高于绿色杂交后代（GH、GS）;在烟草NC89中异位表达AhMYB113,能够促进花青素积累,使得转基因烟草叶片转变为紫色,随着叶龄增长叶片紫色逐渐加深,花瓣、雄蕊（花丝、花药）、雌蕊（柱头、花柱）、萼片等组织也分别呈现为紫红色或紫黑色。     

‘红阳’猕猴桃中花青素转录调控因子AdGL3的克隆及表达分析

为阐明转录因子在猕猴桃果肉花青素形成过程中的调控作用,采用3′RACE和5′RACE技术从‘红阳’猕猴桃果肉中克隆到一个bHLH型转录调控因子AdGL3。实时荧光定量PCR结果表明,AdGL3基因的表达水平与猕猴桃花青素的净积累过程基本一致,即在净积累过程中表达水平比较高,而净积累停止后,该基因的表达水平也相应降低。表明该基因是参与猕猴桃花青素合成的重要调控因子之一。结果为下一步猕猴桃花青素形成机制及调控机理的研究奠定基础。     

大豆Glyma.18G261700基因生物学分析及功能初探

MYB是参与花青素合成的重要调控基因,数量众多且功能多样。为分析大豆中与花生黑色种皮调控基因AhTc1(MYB家族)同源基因的功能,本研究根据AhTc1基因序列信息,同源克隆大豆MYB家族基因Glyma.18G261700,对其进行生物信息学分析,并检测不同种皮颜色大豆苗期不同部位花青素和基因表达量。结果显示：Glyma.18G261700全长1 572 bp,编码189个氨基酸,属于R2R3型MYB。AhTc1编码的蛋白为疏水性蛋白,而Glyma.18G261700与之不同,编码的蛋白为亲水性蛋白。三级结构中Glyma.18G261700与AhTc1尾部有所区别,在调控种皮颜色中可能具有不同功能。不同种皮颜色大豆幼苗根部花青素含量较低,而Glyma.18G261700基因的表达量较高,表明在大豆幼苗期该基因的大量表达可能抑制根部花青素的合成,但对种皮颜色的调控还需进一步探索。     

巴西橡胶树磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表达模式分析

蔗糖是橡胶生物合成的主要碳源,而磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,克隆橡胶树SPP家族基因并研究其表达特性,将有助于揭示橡胶树中蔗糖合成代谢的分子调控.本研究利用拟南芥和杨树的SPP氨基酸序列为探针,搜索橡胶树EST和基因组数据库,并设计引物进行PCR扩增,得到1个橡胶树SPP基因的cDNA和基因组序列,命名为HbSPP1.序列分析显示,HbSPP1基因组含有8个外显子、7个内含子,其cDNA序列的编码区(CDS)为1278 bp,编码424个氨基酸,蛋白分子量为48.1 ku,等电点为6.02.进化上,HbSPP1基因与杨树SPP基因的亲源关系比拟南芥要近.组织特异性表达分析发现,HbSPP1在叶片中的表达丰度最高.另外,在叶片不同发育阶段中,HbSPP1在稳定期叶片中的表达明显低于幼期叶片.     

茶树CsANS基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

采用RACE技术,获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶(ANS)基因的c DNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明,Cs ANS全长c DNA为1 000 bp,其中ORF(Open Reading Frame)为957 bp,编码320个氨基酸,含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域;分离得到Cs ANS基因上游调控序列1 010bp,其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1(光响应元件)、circadian(生物钟相关元件)等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,该基因在全光照处理(CK)时表达量较高,75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。     

中国水仙查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶(CHI)是影响类黄酮合成的一个重要限速酶,在植物花色发育过程中起着重要作用.通过RT-PCR和RACE技术从中国水仙的花瓣中克隆得到3条CHI基因,分别命名为NtCHIW、NtCHIJ和NtCHIY.3个基因均含有一个735 bp的开放阅读框(ORF),编码244个氨基酸.氨基酸序列分析表明:白花水仙与金...     

菠萝R2R3-MYB基因家族鉴定与表达分析

R2R3-MYB转录因子参与植物众多生命活动的调控,在植物生长发育中至关重要。本研究采用生物信息学分析方法,从菠萝基因组中筛选鉴定R2R3-AcMYB转录因子,并对其基因结构、编码蛋白和系统进化进行了分析;基于转录组数据和荧光定量PCR分析,研究了乙烯利处理后菠萝顶端分生组织MYB基因的表达模式。研究结果显示,菠萝基因组含有103个R2R3-AcMYB转录因子,其中67个的基因结构组成为3（外显子）+2（内含子）,17个为2（外显子）+1（内含子）。103个R2R3-AcMYB蛋白中,有31个偏碱性,55个显酸性和17个呈中性。亚细胞定位预测显示,有67个编码蛋白定位于细胞质,20个定位于细胞核。保守基序分析发现,有91个R2R3-AcMYB的序列包含SANT结构的motif 1和motif 2。系统进化树分析表明,81个R2R3-AcMYB转录因子可以分别被归入18个亚组,其余22个R2R3-AcMYB转录因子则未能进行明确归类。基于转录组数据和荧光定量PCR分析结果,发现菠萝顶端分生组织中多个MYB基因的表达受到乙烯利的诱导或抑制,暗示这些基因可能参与了乙烯利诱导条件下菠萝生长发育（包括开花诱导等）调控。这些研究结果为进一步挖掘菠萝激素响应、生长发育和开花调控等基因,揭示菠萝生长发育调控机制提供了数据支持。     

花青素合成关键酶基因的定位及结构分析

为研究大豆花青素合成途径关键酶的基因标记和结构信息,利用大豆基因组和染色体标记数据,对16个花青素合成关键酶基因(苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合酶(CHS,包括9个成员)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和4-香豆酰CoA连接酶(4CL),进行基因遗传图和物理图定位和基因结构分析.结果表明:16个基因分别定位在A1、A2、B1、B2、D1a、D1b、D2、I、K、O等10个连锁群上,并获得了基因所在序列两侧标记.利用大豆的cDNA和gDNA序列信息,获得了16个基因的结构,外显子数目1～7个,内含子数目0～6个,其中PAL、DFR2、GmCHS7是单外显子基因,4CL、CHI、F3H、GmCHS1、GmCHS5、GmCHS8有1个内含子,DFR1、GmCHS2、GmCHS3、GmCHS6有2个内含子,GmCHS4、GmCHS9有3个内含子,GmIRCHS则有6个内含子.     

芸芥与芸薹属属间杂交亲和性研究

选用 5个芸芥与 6个芸薹属种进行杂交 ,研究了芸芥与芸薹属属间杂交的亲和性 ,试验结果表明 :芸芥与芸薹属的远缘杂交属于高度不亲和 ,结角率为 2 .76 % ,结籽率为 1.35 %。影响其杂交亲和性的因素有杂交亲本基因型、杂交组合方式 ,其中以芸薹属作母本的杂交亲和性要高于以芸芥作母本的组合的杂交亲和性。     

中国水仙NtMYB1基因的克隆及表达分析

为研究调控花青素合成机制,利用RT-PCR和RACE技术从中国水仙‘金盏银台’（Narcissus tazetta var. chinensis‘Jinzhan Yintai’.）的花瓣和副冠中克隆得到一个MYB基因的cDNA序列,命名为NtMYB1,在GeneBank上登录号为KC763973。序列分析表明,NtMYB1基因全长842 bp,其中开放阅读框长681 bp,编码226个氨基酸,推测的蛋白分子量为25.2 ku,理论等电点为7.94。NtMYB1具有明显的R2R3-MYB结构域,且在R3结构域的下游含有一个相对保守的PDLNLDLSIG氨基酸基序。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与陆地棉、甜樱桃的MYB蛋白相似性分别达到65％和63％。利用实时荧光定量PCR技术检测NtMYB1基因在中国水仙花不同发育时期和部位的表达水平,分析结果表明,NMYB1基因在中国水仙成花不同时期均有表达,但表达量具有明显差异,其中NtMYB1基因在花蕾期的相对表达量约为花苞期的40倍,且其表达量在花瓣要高于副冠。推测NtMYB1可能参与调控花青素合成基因的转录沉默。     

甘蓝与芸薹属5个近缘物种的基因组原位杂交分析

利用基因组原位杂交(GISH)技术，研究了甘蓝基因组与芸薹属其它5个近缘物种基因组间的相互关系。以标记的甘蓝(CC，2n=18)的基因组总DNA为探针，分别同二倍体甘蓝、白菜型油菜(AA，2n=20)、黑芥(BB，2n=16)和异源四倍体芥菜型油菜(AABB，2n=36)、埃塞俄比亚芥(BBCC，2n=34)、甘蓝型油菜(AACC，2n=38)的中期染色体杂交，甘蓝、白菜型油菜和甘蓝型油菜的所有染色体上都有杂交信号，不能区分A、C基因组。黑芥染色体上只有零星的弱小信号，埃塞俄比亚芥的中期染色体显示出18个明显的信号，可以区分出C、B基因组；芥菜型油菜的中期染色体显示出20个明显的信号，其余染色体上信号很弱或无，可以区分出A、B基因组。说明在长期的进化过程中，甘蓝与白菜型油菜、甘蓝型油菜的亲缘关系较近，基因组的分化程度较小，而甘蓝与黑芥的亲缘关系较远，基因组的分化程度较前者高；甘蓝与芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥间的亲缘关系介于上述二者之间。     

水稻分支酶基因 Sbe1和 Sbe3 cDNA的克隆及全序列分析

 通过改良的RT PCR法合成了水稻未成熟种子胚乳cDNA库，并以此为模板，用PCR技术从粳稻品种武运粳7号中克隆了分别编码淀粉分支酶SBEⅠ和SBEⅢ的2个基因Sbe1和Sbe3。序列分析表明，克隆Sbe1和Sbe3基因的大小分别为2490 bp和2481 bp，包含了基因完整的编码序列。Sbe3基因与已发表基因全序列完全相同，同源性达100%；Sbe1基因与已发表基因序列有4个碱基不同，同源性为99.84%，推导氨基酸序列的差异为2个。     

茶树紫芽中花青素形成相关基因差异表达分析

花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素,作为一种强自由基清除剂,它具有抗炎,抗氧化,降血压,降血糖等多种保健功能。紫芽茶树作为一种高花青素含量的特异性茶树资源,其研究与利用越来越受人们的关注。为了解茶树紫芽中花青素形成的分子机理,本研究通过对湖南农业大学自选紫芽品种9803与绿芽品种9806进行转录组测序及生物信息学分析,筛选得到42条与花青素代谢相关的unigene,其中比对到参考基因组中的有34条,未在参考基因组中登录的有8条。KEGG富集分析表明这42个基因被富集到5个代谢通路中,包括类黄酮合成途径,木质素合成途径,黄酮和黄酮醇合成途径,油菜素甾醇合成途径,以及参与转录因子的编码。通过荧光定量PCR验证,差异基因荧光定量PCR变化趋势与转录组测序结果一致,转录组测序数据可靠。本次试验在转录组水平上筛选出了茶叶紫芽花青素代谢相关的差异基因,为进一步揭示茶叶紫芽产生的分子机理奠定了基础。     

萝卜芥蓝异源四倍体 与埃塞俄比亚芥属间杂交

萝卜芥蓝异源四倍体(Raphanobrassica, RRCC, 2n = 36)与埃塞俄比亚芥(B rassica carinata, BBCC, 2n = 34)正反交,结果表明:萝卜芥蓝异源四倍体×埃塞俄比亚芥可交配率为7. 3% ,反交为64. 6%。正反交F1 植株均 呈双亲中间形态,体细胞染色体数目为35,花粉母细胞减数分裂染色体主要配构型为10Ⅱ + 15Ⅰ。62个F2 植株 和22个与埃塞俄比亚芥的回交植株的形态为中间类型、偏萝卜芥蓝异源四倍体或偏萝卜。AFLP检测到F2 和BC1 植株均含有大量双亲特异片段,聚类分析表明,这些植株独立于亲本种聚成一组。     

香蕉枯萎病菌2个生理小种MAPK基因的克隆及序列分析

为了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)1号生理小种(race 1)和4号生理小种(race4)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因focMK1,focMK4的序列差异,根据番茄枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的MAPK基因相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,分别克隆了香蕉枯萎病菌2个生理小种的基因序列和开放阅读框。结果表明,所获得的2个MAPK基因均含有3个内含子和4个外显子,2个基因序列只有一个碱基差异,编码氨基酸355个,氨基酸组成无差异;根据生物信息学软件预测编码蛋白没有信号肽,具有2个功能位点,分子量和pI分别为41ku和6.47。该基因编码的蛋白具有高度保守性,与大多数植物致病菌的同源性都在90%以上,不同病原镰刀菌间的同源性接近100%。     

花生(Arachis hypogaea L.)CaM cDNA基因的克隆

提取花生幼嫩叶片总RNA,以逆转录cDNA第一链为模板,合成5'端和3'端引物,PCR扩增并克隆得到花生钙调蛋白基因的2个异型基因.序列分析表明,PCaM-1和PCaM-2均由447个核苷酸组成,共编码148个氨基酸.2个cDNA的核苷酸序列同源性为84%,编码区的氨基酸序列同源性为96%,仅有5处替换:F-L、T-A、M-T、M-T和L-F.     

茶树CsRAV2转录因子基因的克隆与表达特性分析

RAV转录因子是AP2/ERF家族的成员之一,在植物生长发育和逆境调控中起着重要作用。本研究以安吉白茶和迎霜这两个茶树（Camellia sinensis）品种为试验材料,通过PCR和RT-PCR方法分别从两种茶树的DNA和cDNA中克隆得到CsRAV2基因。分析显示,来源于两种茶树中的CsRAV2基因全长均为1 089 bp,没有内含子,分别编码362个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性、三级结构上分析显示,茶树中CsRAV2转录因子是亲水性蛋白。茶树中CsRAV2转录因子与拟南芥AtRAV具有相似的三级结构。实时定量PCR分析表明,茶树中CsRAV2基因在茶树根中表达量最高,高温、低温、NaCl处理均能诱导该基因表达,不同品种间存在差异。