检测山羊贝氏柯克斯体抗体的间接ELISA方法的建立

以贝氏柯克斯体Ⅱ相全菌病原体沉淀作为抗原包被酶标板,建立检测山羊贝氏柯克斯体的间接ELISA (i ELISA)方法,用该方法和美国爱德士贝氏柯克斯体检测试剂盒同时对445份临床山羊血清样品进行检测,评价二者的符合率。通过对i ELISA方法的关键反应条件进行优化,最终确定该方法的抗原包被浓度是0.5μg/mL,包被条件是4℃过夜;封闭液是10 g/L酪蛋白,封闭时间是45 min;血清稀释度是1∶400,反应时间是45 min;酶标二抗稀释度是1∶5 000,反应时间是30 min。经验证,建立的方法敏感性、特异性和重复性良好,与爱德士试剂盒的符合率为97.98%,证明该方法可用于山羊贝氏柯克斯体抗体的临床筛查。     

大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法的建立

旨在建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法。经琼脂糖凝胶层析纯化大豆抗原蛋白,以不同剂量皮下注射免疫小鼠,采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法,利用该方法检测小鼠免疫后血清抗体水平。通过方阵滴定法确定11S蛋白最佳包被浓度为5.0μg/mL,血清稀释倍数为1∶800;7S蛋白抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清稀释倍数为1∶1 600;两者的批内、批间系数均小于10%,重复性较好,通过ELISA法确定11S和7S蛋白的最佳免疫次数为2次,免疫剂量为1 000μg/kg。结果表明本试验初步建立大豆抗原蛋白抗体检测间接ELISA方法,具有很强的特异性、敏感性和重复性,可用于大豆抗原蛋白过敏反应的临床检测。     

Q热贝氏柯克斯体间接ELISA检测方法的建立

本研究以Q热贝氏柯克斯体弱毒株Ⅱ相全菌为包被抗原建立Q热贝氏柯克斯体间接ELISA检测方法,通过方阵滴定法对抗原包被浓度和二抗反应浓度的确定及各项反应条件的优化,确定其阴阳性临界值为0.44。用本方法与IDEXX Q热抗体检测试剂盒对393份牛临床血清进行检测,检出的血清阳性率分别为11.45%和6.10%,符合率为94.66%。结果表明,本试验建立的检测Q热贝氏柯克斯体的间接ELISA法具有较好的特异性及较强的敏感性,可初步应用于Q热贝氏柯克斯体抗体的临床检测。     

山羊传染性胸膜肺炎ELISA诊断试剂盒的研发及应用

山羊传染性胸膜肺炎ELISA诊断试剂盒是应用1998年分离研究的丝状支原体山羊亚种“贵罗P G3”作为包被抗原,以抗原包被浓度62 mg/mL,血清稀释度倍数1∶100作为最佳工作条件,其阳性血清D 492 nm值S＞1、阴性血清D 492 nm值N≤0.5,且具有良好的稳定性。经山羊血清样本反复检测试验表明,其有效率达96.11%,经与山羊传染性胸膜肺炎间接血凝P G3、Y 98诊断试剂试验检测比对,ELISA试剂盒对丝状支原体山羊亚种P G3具有较强的敏感特异性。在贵州省部分养羊基地县的推广应用过程中,其对872份非免疫山羊血清样本进行了阳性抗体检测,其平均阳性率达28.33%。这充分表明,本试验建立的ELISA诊断试剂盒对山羊传染性胸膜肺炎P G3的阳性抗体检测具有良好的敏感特异性。     

绵羊肺炎支原体P6058aa-928aa蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】 建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】 利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】 经DNAStar分析,P60蛋白第58－928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P60_58aa-928aa)抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P60_58aa-928aa基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2 048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】 本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。     

猪肺炎支原体融合蛋白MHP-P46-P36的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

利用生物学软件分析猪肺炎支原体P46蛋白和P36蛋白的抗原决定簇,将抗原表位富集区进行串联,表达融合蛋白MHP-P46-P36。以融合蛋白MHP-P46-P36作为包被抗原,优化反应条件建立肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示：融合蛋白MHP-P46-P36以可溶性形式高效表达;ELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度10 mg/L, 1%BSA封闭60 min,一抗最佳稀释度1∶40且37℃60 min,二抗最佳稀释度1∶4 000且37℃60 min,最适显色时长15 min, cut-off值为D_{450 nm}=0.385;与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪蓝耳病病毒和猪圆环病毒阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性;阴阳性血清的组内和组间变异系数均小于7%,具有较好重复性;52个样品临床样本检测结果显示,建立的ELISA方法与IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒相比,阳性样本的符合率为83.09%。     

非洲猪瘟病毒CD2v抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

为建立血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,研究真核表达ASFV CD2v重组蛋白,并以纯化的蛋白为包被抗原,通过反应条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原的最佳包被浓度为10μg/m L,待检血清的最佳稀释倍数为1∶25,最佳封闭液为1%BSA与明胶封闭缓冲液,酶标抗体最佳稀释度为1∶2 000,最优二抗稀释液为PBST,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.366。该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达1∶50,批内重复性和批间重复性变异系数分别为2.2%～9.4%和4.7%～8.1%。试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可初步应用于ASFV抗体检测。     

应用间接ELISA检测猪旋毛虫抗体

以猪旋毛虫抗原基因Ts88的重组蛋白为包被抗原,建立了猪旋毛虫抗体间接ELISA检测方法。最佳抗原包被浓度为1μg/mL,待检血清的最佳稀释倍数为1:80。采用间接ELISA方法检测2000份猪血清,阳性检出率为1.5%,血清样本对应猪肉采用镜检法,阳性检出率为1.30%。试验结果显示,该方法操作简便、快速、特异性好,适用于猪旋毛虫的临床诊断和流行病学调查。     

应用间接ELISA检测猪旋毛虫抗体

以猪旋毛虫抗原基因Ts88的重组蛋白为包被抗原,建立了猪旋毛虫抗体间接ELISA检测方法。最佳抗原包被浓度为1μg/mL,待检血清的最佳稀释倍数为1:80。采用间接ELISA方法检测2000份猪血清,阳性检出率为1.5%,血清样本对应猪肉采用镜检法,阳性检出率为1.30%。试验结果显示,该方法操作简便、快速、特异性好,适用于猪旋毛虫的临床诊断和流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿rAP1-BP-AP2重组蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立了奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体的间接ELISA检测方法。优化后抗原的最佳包被量为5.0μg/孔,血清样品最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶5 000。对S.agalactiae、S.pyogens、E.coli、S.aureus、S.epidermidis阳性血清进行检测结果显示,后4种阳性对照血清未出现阳性反应,表明该方法具有良好的特异性;对已知牛无乳链球菌阳性血清倍比稀释后进行检测时,当稀释倍数达到1:12 800时仍出现阳性结果,表明该方法具有较高的敏感度;重复性试验显示批内变异系数为2.41%~8.89%,批间试验变异系数为7.53%~10.46%;用该方法对426份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,结果显示,其样品阳性检出率为45.07%。本研究首次基于乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿三联重组蛋白建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种准确、可靠的检测方法。     

猪沙波病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

以原核表达重组蛋白作为抗原建立了猪沙波病毒(SaV)抗体的间接ELISA检测方法。使用矩阵滴定法确定抗原包被浓度为6.4μg/mL,血清稀释倍数为1∶50。试验选用1%BSA作为封闭液,血清和二抗的最佳作用时间分别为60 min和40 min。选择无致癌的TMB为底物,确定TMB最佳反应时间为10 min。通过对20份猪阴性血清样品的检测,计算阳性判定值为0.203。通过交叉试验、批内和批间重复性试验证明,本研究建立的SaV间接ELISA检测方法具有特异性高,重复性好的特点,可用于猪沙波病毒抗体的检测。     

应用间接ELlSA检测猪旋毛虫抗体

以猪旋毛虫抗原基因Ts88的重组蛋白为包被抗原,建立了猪旋毛虫抗体间接ELISA检测方法。最佳抗原包被浓度为1μg/mL,待检血清的最佳稀释倍数为1：80。采用间接ELISA方法检测2000份猪血清,阳性检出率为1．5％,血清样本对应猪肉采用镜检法,阳性检出率为1．30％。试验结果显示,该方法操作简便、快速、特异性好,适用于猪旋毛虫的临床诊断和流行病学调查。     

伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立伪结核棒状杆菌(Cp)血清抗体间接ELISA检测方法,以热灭活处理的不同的浓度Cp菌株作为固相抗原包被酶标板,用不同封闭液封闭,设置不同的封闭时间,再用不同稀释度的待检血清和不同稀释度的酶标二抗与之反应,以此优化间接ELISA反应条件,确定阳性临界值。对间接ELISA方法的特异性和重复性进行试验,并在此基础上对采集的临床样本进行检测。结果显示,最佳抗原包被量为OD600 nm=0.084的菌悬液100μL,10 g/L BSA封闭时间2 h,一抗血清稀释度为1∶400,酶标二抗的稀释度为1∶5 000,血清阴阳性的OD450 nm值临界值为0.352。该方法仅对Cp阳性血清呈特异性反应,与6种常见病原阳性血清均无交叉反应,特异性较强。批内试验和批间试验的变异系数均小于9.5%,重复性较好。敏感性试验结果表明,当伪结核标准阳性血清进行1∶1 280稀释时检测仍为阳性,敏感性较强。用该方法对10份经细菌分离鉴定为阳性的血清进行Cp抗体检测,结果均为阳性。用建立的方法对临床随机采集的423份血清进行检测,结果显示阳性率为35%。研究建立的抗体间接ELISA方法为Cp抗体检测及血清学调查奠定了基础。     

绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测绵羊家畜衣原体血清抗体的间接ELISA方法,本试验构建pET-28b-ompA重组表达质粒,经诱导表达和纯化后,对重组主要外膜蛋白(MOMP)进行Western blot鉴定;以MOMP为包被抗原,通过反应条件筛选建立绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、重复性和符合性,并进行临床样品检测。结果显示,MOMP以包涵体形式表达,经Western blot鉴定重组蛋白具有良好的反应原性。优化反应条件为：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃静置孵育1 h;血清抗体稀释倍数为1∶100,37℃反应1 h;酶标二抗稀释倍数为1∶5 000,37℃孵育1 h;底物显色条件为37℃避光5 min。利用52份绵羊血清确定ELISA方法的阳性判定临界值为P/N=2.156。该方法的敏感性、特异性和重复性较高。用该方法与间接血凝试验对86份血清进行检测,两者符合率为73.2%。用该方法对临床采集的205份绵羊血清样品进行检测,阳性率为34.1%。结果表明,本试验建立的绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法具有较高的特异性和敏感性,可应用于临床检测。     

猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值竞争ELISA检测方法的建立

为了建立猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值竞争ELISA检测方法,试验以猪肺炎支原体全菌体为包被抗原,以抗猪肺炎支原体高免血清为检测抗体,建立猪肺炎支原体竞争ELISA抗原检测方法,并验证方法的灵敏度、特异性,再根据量反应平行线测定法原理建立猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值检测方法,并考察方法的批内和批间重复性。结果表明:建立了猪肺炎支原体竞争ELISA反应体系,包被抗原浓度为32μg/mL,阳性血清稀释度为1∶25 000,阴性血清稀释度为1∶320;封闭液为5%脱脂奶粉,封闭时间为1.5 h;酶标二抗稀释度为1∶20 000,作用时间为1.5 h; TMB显色时间为室温15 min;试验成立条件为阳性血清OD₄₅₀值0.7～2.0,阴性血清OD₄₅₀值<0.3;该方法线性相关系数为0.995 5,线性范围为10～1 280μg/mL,与猪细小病毒、猪流感病毒、猪鼻支原体等8种异源蛋白无交叉反应。在猪肺炎支原体竞争ELISA抗原检测体系的基础上成功建立了灭活疫苗相对效力值检测方法,该法的批内变异系数<5%,批间变异系数<10%;...     

绵羊支原体HSP70的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号：CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。     

绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法的建立

为了建立特异性好和敏感性高的绵羊肺支原体抗体ELISA检测方法,以绵羊肺炎支原体Y98标准菌株的全菌蛋白作为抗原,进行了反应体系和反应条件的优化筛选。结果显示:最佳蛋白抗原包被浓度为1.52μg/mL,最适封闭液及其稀释浓度为1%BSA,血清样品的稀释度为1/50,兔抗山羊IgG的最适稀释浓度为1/4 000,一抗和二抗的最佳作用时间为37℃60 min,底物显色的最佳时间为10 min;通过与绵羊肺炎支原体抗体间接血凝试验(IHA)检测结果相比,60份羊血清样品中Y98 ELISA检出阳性为33份,阴性为20份,二者的检测符合率可达到88.33%,相对特异性达90.90%。提示:建立的绵羊肺炎支原体血清抗体检测方法具有较高的检测敏感性和特异性,为绵羊肺炎支原体的抗体检测及其感染的流行病学调查提供了一种快速简便的检测工具。     

基于绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白间接ELISA方法的建立

为解决绵羊肺炎支原体感染的预防问题,建立一种简单、快速、成本低的诊断方法,构建绵羊肺炎支原体EF-Tu基因原核表达载体,诱导纯化重组蛋白并用Western blot分析其反应原性,以重组蛋白为诊断抗原,建立绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法,评估其特异性和灵敏性。结果表明,构建的重组蛋白纯化后,经Western blot证实具有良好的反应原性;间接ELISA反应条件优化显示,抗原稀释度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为50 g/L脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为88.7%。说明试验建立的绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法可以推广使用。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，利用大肠杆菌表达系统成功表达E2蛋白并纯化，利用纯化后的蛋白作为包被抗原，用方阵法对影响ELISA试验的各个因素进行优化，并进行特异性、敏感性和重复性试验。确定E2抗原最佳包被浓度为1μg/mL,最佳血清稀释度为1∶40,最佳封闭液为1%明胶，最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min;最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD_450nm≥0.255。与血清中和试验和商品化试剂盒进行比较，总符合率分别为98%和96%,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与其它常见牛病毒阳性血清均无交叉反应。本研究成功建立了间接ELISA方法，为进一步用于大批量牛血清样本的抗体检测和流行病学研究奠定了基础。