碱蓬多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶,是碱蓬甜菜红素合成的第一关键酶.以盘锦红海滩碱蓬(盐地碱蓬)为研究材料,采用同源克隆法,根据植物中已克隆出的PPO序列进行引物设计,利用RT-PCR和RACE技术,从碱蓬中克隆出的PPO基因cDNA全长为1830bp,编码609个氨基酸.序列分析表明,与其他植物PPO核苷酸序列的相似性为69％～87％,氨基酸的相似性为49％～62％.碱蓬多酚氧化酶基因的成功克隆,为碱蓬甜菜红素的研究和利用打下了坚实的理论基础.     

亚洲玉米螟幼虫体内酚氧化酶原cDNA片段的克隆

利用昆虫酚氧化酶原(PPO)基因序列设计简并引物，采用RT-PCR方法从亚洲玉米螟幼虫体内扩增了一段522个核苷酸的eDNA片段，编码174个氨基酸。经Blastp分析表明，该段氨基酸序列同鳞翅目和双翅目中PPO的相同区域具有较高的相似性(39％一63％)。其中与烟草天蛾PPO的相似性最高(63％)；与家蚕、大蜡螟、惜古比天蚕蛾PPO也有较高的相似性。在该片段中含有1个该类酶原中保守的2个铜离子结合位点之一(含4个组氨酸残基)。据此推断克隆的片段为PPO基因片段。     

烟草WS38生长素结合蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以烟草WS38为材料,根据GenBank中登录的烟草生长素结合蛋白(ABP1)氨基酸序列设计引物,通过RT-PCR克隆了烟草WS38ABP1基因cDNA分子编码区,序列全长为564bp,可编码1条188个氨基酸的多肽.利用ClustalX软件对该序列翻译获得的多肽序列与报道的烟草生长素结合蛋白氨基酸序列比较,两者同源性为98.4%,存在2个氨基酸的差异,但差异氨基酸对ABP1结构和功能影响微弱.认为克隆的cDNA序列即为烟草WS38ABP1cDNA,不同品种烟草ABP1基因存在的核苷酸单位点多态性(SNP)造成了两者氨基酸序列的差异.     

烟草植物螯合肽合成酶PCS1基因的电子克隆和序列分析

为了研究烟草中重金属镉的代谢转运基因,以马铃薯的植物螯合肽合成酶phytochelatin synthases 1(PCS1)基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:AJ548472.1)为信息探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个植物螯合肽合成酶基因(NtPCS1),并对其进行了序列分析。序列分析结果:NtPCS1包含完整的开放读码框,编码531个氨基酸,含有2个保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin;通过同源比对和进化分析发现,NtPCS1氨基酸序列与番茄PCS1的序列一致性达到85%,与已报道的树烟草NgPCS相比,在N端多出30个氨基酸。以上结果表明NtPCS1是栽培烟草中新发现的金属镉代谢转运基因。     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

烟草(云烟87)NBS-LRR类同源抗病基因克隆及分析

[目的]克隆并分析烟草NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGAs),为采用同源克隆技术挖掘烟草抗病基因提供理论参考.[方法]从基于NBS-LRR类抗病基因保守序列设计的简并引物中筛选扩增效果较好的引物用于扩增烟草RGAs,采用DNAMAN 6.0翻译成氨基酸序列,并与已知的其他植物抗病基因进行聚类分析.[结果]克隆获得6条与参比抗病基因具有高度同源性的烟草RGAs,大小在500 bp左右,但仅有4条RGAs具有连续的开放阅读框(ORF)及编码NBS功能结构域的核苷酸序列,命名为TRGA-87-1~TRGA-87-4.这4个烟草RGAs编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病蛋白的多个典型保守基序,与已知的多种植物抗病基因编码的氨基酸序列均具有较高的相似性,其中,与烟草相关抗病基因编码的氨基酸序列相似性最高,为97.00%~100.00%,与其他植物的抗病基因编码氨基酸序列相似性为29.00%~53.00%,这些序列可分为3个亚类,其中TRGA-87-2与烟草N和亚麻L6聚为一类(TRGAⅠ),属于TIR-NBS-LRR类;TRGA-87-3和TRGA-87-4与水稻Xa-1和番茄Mi聚为一类(TRGAⅡ),属于non-TIR-NBS-LRR类,TRGA-87-1与拟南芥RPM1聚成一类(TRGAⅢ),属于non-TIR-NBS-LRR类.[结论]同源扩增技术可用于烟草中抗病基因的克隆、功能分析及定位等研究.     

板栗PPO基因克隆及生物信息学分析

【目的】研究PPO基因在栗仁受热褐变物质代谢中的生理功能。【方法】在对板栗果实转录组测序的基础上,获得1条PPO unigenes,克隆并对其进行生物信息学分析。【结果】克隆PPO基因完整开放阅读框1794 bp,命名为CmPPO,编码597个氨基酸,属于络氨酸酶基因家族蛋白,包含络氨酸普通中心区域和多酚氧化酶中间保守域。CmPPO编码的多酚氧化酶属于亲水性蛋白质,相对分子量66 335.38,理论等电点(pI)6.45,属于酸性蛋白,不存在跨膜区,不属于膜结合蛋白。CmPPO蛋白酶的二级结构α-螺旋比例21.22%,无规则卷曲59.13%,延伸主链15.91%,β-转角3.85%。三级空间结构模型分析与蔷薇科苹果络氨酸酶结构(MdPPO1)有72.75%的序列一致度,53%的序列相似度,氨基酸序列一致性达到68.43%,推测它们具有类似功能。通过qRT-PCR验证,CmPPO基因在板栗不同品种、果实不同组织中表达差异与果实褐变度不一致,在弱褐变品种中表达却最高。【结论】褐变不是单基因控制,而是多基因、多种代谢途径共同参与作用的结果。     

烟草蛋白酶体α2型亚单位的克隆和序列分析

为研究烟草识别病毒并将其降解为蛋白酶体基因,以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长c DNA序列(Gen Bank登录号:AF043520.1)为信息探针,用电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个蛋白酶体基因Nt PAB1,并对其进行序列分析。结果表明,Nt PAB1包含完整的开放读码框,编码219个氨基酸,含有1个保守域proteasome_alpha_type_2;通过同源比对和进化分析发现,Nt PAB1氨基酸序列与葡萄PAB1的序列一致性达到98%。以上结果表明,Nt PAB1是栽培烟草中未报道的编码蛋白酶体基因。     

植物和真菌多酚氧化酶的分子生物学研究进展

多酚氧化酶(PPO)是细胞内酶促褐化反应的主要催化酶类,同时PPO催化的反应还可应用于多巴药物的生产、含酚污水的净化等方面。现在已经从多种植物和真菌中分离和克隆了PPO及其基因。阐述了多酚氧化酶的结构与功能特点,总结了目前已克隆的植物和真菌多酚氧化酶基因,分析其表达特性,并介绍了转基因方面的研究现状。     

香蕉PPO基因的克隆及原核表达

为进一步在蛋白水平上研究香蕉PPO功能及获得抗酶促褐变的香蕉新品种,通过PCR从巴西蕉中扩增出多酚氧化酶基因(PPO)全长序列,并进行进化树分析与SDS-PAGE电泳检测。结果显示:多酚氧化酶基因全长1 767bp,编码588个氨基酸,GenBank登录号为KF900300.1。与其他物种PPO基因的氨基酸序列有很高的结构相似性,并同时具有保守结构域CuA和CuB,香蕉PPO蛋白与菠萝亲缘关系最近。另外,成功构建原核表达载体pQE80L-MaPPO1,并转化E.coli M15,但未表达出目的蛋白,推测可能与MaPPO1中存在导肽有关。     

不同成熟度对烤烟叶片膜脂过氧化特性的影响

研究了不同成熟度对河南南阳烤烟叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)及丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明:(1)随着烤烟烟叶成熟度的加深,SOD、POD、PPO活性总体呈现先上升后下降,MDA含量总体上则呈现持续增加的趋势,且在不同的成熟期,各种酶活性出现的峰值不同,中上部叶PPO活性的峰值出现在成熟档次,下部叶PPO活性的峰值出现在尚熟档次;而POD活性和SOD活性的峰值在中上部叶中分别出现在欠熟档次和尚熟档次。(2)PPO、SOD、POD活性从未熟至成熟均表现出中上部叶活性大于下部叶,在尚熟-成熟阶段下部叶SOD、POD和PPO活性急剧下降。综合评价认为,下部叶应在尚熟-成熟阶段采收,中上部叶应在成熟-过熟阶段采收。     

VFB诱导烟草叶片生理生化变化与TMV抗性的关系

用VFB对烟草花叶病进行预防和治疗处理,对其抗TMV作用进行初步探讨。结果表明：用VFB的两种处理方式均可使受侵普通烟的叶绿素总含量明显升高,且预防处理要好于治疗处理;可显著降低丙二醛(MDA)的含量;可诱导普通烟中多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)的活性增强。可见,VFB是一种良好的植物源病毒抑制剂,可诱导植物产生抗病性,增强对TMV侵染的抵抗力。     

紫竹多酚氧化酶基因克隆及其表达

为研究紫竹Phyllostachys nigra多酚氧化酶基因（PPO）表达与紫竹组培苗褐化之间的关系,采用同源克隆方法获得紫竹PPO基因的cDNA与DNA片段,将它命名为PnPPO。随后,研究了该基因在不同褐化程度紫竹组培苗中的表达情况。序列分析显示该基因所编码蛋白为酪氨酸酶（tyrosinase）,其序列与小麦Triticum aestivum和水稻Oryza sativa中PPO基因同源性很高,是PPO的同源序列。RT-PCR分析显示,在褐化严重的组培苗中PnPPO的表达量也较高。这说明PnPPO基因的表达与紫竹组培苗褐化存在紧密的联系。图4参15     

巴西橡胶树HbMT2植物表达载体的构建及遗传转化烟草

将巴西橡胶树金属硫蛋白基因HbMT2插入到植物表达载体pCAMBIA 1304,得到HbMT2基因的植物表达载体pCAMBIA1304-HbMT2.通过电击法将该载体导入根癌农杆菌菌株中并转化烟草.将获得的具有潮霉素(Hyg)抗性的再生植株进行PCR鉴定.结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中.抗逆性分析试验显示,转基因烟草对H202处理和紫外线照射耐受性显著提高;重金属离子胁迫下,转基因烟草叶绿素含量、过氧化物酶和过氧化氢酶活性明显高于对照.     

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L.）NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。     

轮状病毒疫苗基因转化烟草的研究

以烟草叶片的切段为外植体,用含有轮状病毒疫苗基因的农杆菌浸泡5 min,然后共培养2 d,再转入MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA0.1 mg/L,添加100 mg/L卡那霉素和500 mg/L氨苄青霉素的筛选培养基上筛选,得到卡那霉素抗性苗32株。对其中的4株卡那霉素抗性苗进行PCR分子检测,结果表明,目的基因已经整合进烟草基因组中。     

The Research of Bt and OC Gene Cotransformation in Tobacco Chloroplast

The Bt Cry IA (C) chloroplast expression cassette and OC chloroplast expression cassette were constructed. The Bt expression cassette contained the 3.5 kb wild type Bt Cry IA (C) gene under the control of the strong light-induced psbA promoter and terminator from rice (Oryza sativa. L) chloroplast, the gene:trnH-psbA-trnk from tobacco (Nicotiana tabacum. L) as the homologous fragment. The OC chloroplast expression cassette contained the OC gene under the control of 16S promoter and terminator from tobacco, the tobacco gene: psbA-ORF512 as homologous fragment. The two cassettes both had the aadA gene expression cassette as the selectable marker. Leaves of tobacco were cotransformed with the particle bombardment method. After selection by spectinomycin, the transformants were obtained. The integration of Bt and OC gene were confirmed by Southern-blotting analysis, and Western-blotting analysis. Proteinase inhibitor assays showed that the Bt and OC gene had expressed. Bioassays showed that the transgenic tobacco had a significant resistance to the larvae of cotton bollworm ( helicoverpa zea ).     

烟草中依赖于NAD+的山梨醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

以珊西烟(Nicotiana tabacum L.cv Xanthi NN)为材料,通过RT-PCR,首次克隆了烟草中山梨醇脱氢酶基因(NAD+-SDH),该基因全长1119bp,编码372个氨基酸残基,其氨基酸序列与番茄和葡萄的山梨醇脱氢酶同源性分别为92%和87%。     

不同陈化条件下烤烟褐变与氨基酸含量变化关系

通过分光光度法测定不同陈化时间和不同温度、湿度、真空度等陈化条件下烤烟烟叶中氨基酸含量和颜色的变化,并探讨烤烟褐变与氨基酸含量变化间的相互关系。结果表明,烤烟云烟85和翠碧在有氧陈化条件下温度越高、湿度越大,氨基酸含量越低,褐变度越大。因此烤烟在陈化过程中适当保持低温、低湿和隔离空气可减少烟叶褐变。     

双价抗虫基因共转化烟草叶绿体的研究

 分别构建苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因 [BtCryIA(C) ]和水稻巯基蛋白酶基因 (Oryzacystatin ,OC)叶绿体转化载体 ,其中Bt基因叶绿体转化载体以烟草叶绿体基因trnH psbA trnK为同源片段 ,以水稻 (OryzasativaL .)叶绿体 psbA基因启动子和终止子为调控基因 ;OC基因叶绿体表达载体以烟草叶绿体基因片段 psbA ORF5 12为同源片段 ,以烟草叶绿体 16S启动子和终止子为调控基因 ;两载体均以壮观霉素抗性基因 (aadA)为筛选基因。利用基因枪方法 ,共转化烟草叶片 ,获得壮观霉素抗性植株。经Southern、Western检测、表达蛋白活性测定证明 ,双价抗虫基因己整合到烟草叶绿体中并得到表达。转基因植株抗棉铃虫试验表明 ,转基因植株具有显著杀虫活性