瓜叶菊F3＇5＇H基因cDNA的克隆、序列分析及其原核表达

蓝色花的形成主要由于是花瓣中3＇,5＇-羟羟基花青素（飞燕草色素及其衍生物）的相对含量较高,类黄酮-3＇,5＇-羟基化酶（F3＇5H）是合成这类色素的关键酶.不同物种F3＇5＇H同源基因的分离与特征解析能够为蓝色花的分子育种工作提供更多的理论依据.瓜叶菊花色多变,舌状花有白色、红色和蓝紫色等.根据已知F3＇5＇H保守的氨基酸序列设计了3条简并引物,通过RT-PCR从蓝色的瓜叶菊舌状花中扩增出了保守序列;利用RACE方法得到了两端序列.设计全长引物RT-PCR分离出了瓜叶菊F3＇5＇H同源基因（PCFH）.cDNA全长1 660bp,编码505个氨基酸.序列分析表明PCFH编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括血红素结合区、Ⅰ螺旋区和膜插入点的信号序列等.与其它物种的F3＇5＇H基因的序列相似性也较高.与翠菊、拟南芥和矮牵牛的序列相似系数分别为76%、59%和50%.序列相似性表明PCFH基因与茄子、矮牵牛和草原龙胆等同属于CYP75亚家族.利用pET28a载体PCFH在大肠杆菌BL21中实现了表达,IPTG诱导的差异蛋白大约为57kD,PCFH编码的多肽分子量相近,这将为进一步研究PCFH的酶学特性奠定了基础.     

F3′5′H基因与蓝色花的形成

类黄酮-3’,5’-羟基化酶(F3'5'H)是合成蓝色花色素的关键酶,近十多年一直都是蓝色花分子育种领域的研究热点之一。目前已从13种植物中分离到了F3'5'H基因。本文通过对F3'5'H基因已知氨基酸序列进行分析,列出了F3'5'H的功能基序;构建的系统进化树系图体现了各科属间的亲缘关系与进化差异;研究结果表明:不同物种F3'5'H基因的时空表达特性不同,与表达部位的发育进程和着色模式有关;作者还从底物特异性和遗传转化两个方面分析了该基因功能研究的进展。     

绣球花花色相关基因HmF3H的克隆及其表达分析

花色是植物重要的观赏性状之一,而黄烷酮羟化酶是植物花色素物质积累的关键酶,对植物花色差异具有重要影响。本研究利用PCR技术从盛花期蓝色花绣球品种‘无尽夏’不孕花中克隆获得了Hm F3H基因的全长序列,该基因的ORF序列长度为1 095 bp,编码364个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为41.08 k D,理论等电点为5.48,为亲水性蛋白,该蛋白属于PLNO2515超家族成员,具有2-酮戊二酸双加氧酶结构域。系统进化树分析表明,该蛋白与咖啡树和佛手瓜的亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,Hm F3H基因在绣球花不同组织器官中均有表达,红色绣球品种‘粉黛’盛花期不孕花比蓝色绣球品种‘无尽夏’盛花期不孕花中表达量高,说明Hm F3H基因对绣球花花色差异形成具有一定影响。本研究获得了绣球花Hm F3H基因序列及其表达情况,为探讨绣球花品种花色差异形成机制具有一定指导意义。     

花色研究基因新资源:瓜叶菊蓝色花形成相关基因PCFH

花色素苷代谢途径中关键酶基因的研究一直是花色分子育种工作的主要研究对象,其中F3’5’基因是蓝色花卉育种的研究热点。本研究利用PCR—RACE技术从瓜叶菊中克隆到了F3’5’H同源基因PCFH(GenBank登录号：AY791885),为新异花色的分子育种工作提供了新的基因资源。     

瓜叶菊F3''5''H基因cDNA的克隆、序列分析及其原核表达

蓝色花的形成主要由于是花瓣中3',5'-羟羟基花青素(飞燕草色素及其衍生物)的相对含量较高,类黄酮-3',5'-羟基化酶(F3'5H)是合成这类色素的关键酶.不同物种F3'5'H同源基因的分离与特征解析能够为蓝色花的分子育种工作提供更多的理论依据.瓜叶菊花色多变,舌状花有白色、红色和蓝紫色等.根据已知F3'5'H保守的氨基酸序列设计了3条简并引物,通过RT-PCR从蓝色的瓜叶菊舌状花中扩增出了保守序列;利用RACE方法得到了两端序列.设计全长引物RT-PCR分离出了瓜叶菊F3'5'H同源基因(PCFH).cDNA全长1 660bp,编码505个氨基酸.序列分析表明PCFH编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括血红素结合区、Ⅰ螺旋区和膜插入点的信号序列等.与其它物种的F3'5'H基因的序列相似性也较高.与翠菊、拟南芥和矮牵牛的序列相似系数分别为76%、59%和50%.序列相似性表明PCFH基因与茄子、矮牵牛和草原龙胆等同属于CYP75亚家族.利用pET28a载体PCFH在大肠杆菌BL21中实现了表达,IPTG诱导的差异蛋白大约为57kD,PCFH编码的多肽分子量相近,这将为进一步研究PCFH的酶学特性奠定了基础.     

长叶红砂黄烷酮-3-羟基转移酶3基因(RtF3H3)的克隆、表达分析及酵母表达载体的构建

黄烷酮-3-羟基转移酶(F3H)是植物黄酮合成途径上游的一个关键酶,它催化黄烷酮C3位羟化,形成二氢黄酮醇。构建长叶红砂Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。基于高通量转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂F3H3(Rt F3H3,GenBank登录号LC055546)基因,其开放阅读框长1 014 bp,编码338个氨基酸,推测蛋白分子量为38.46 k Da,理论等电点为5.7。通过定量RT-PCR研究发现,Rt F3H3在茎中表达量较高,在根和叶中表达量较低。不同程度Na Cl(100,300,500 mmol/L)和不同时间UV(12,24,36 h)胁迫都能诱导Rt F3H3基因表达量升高。另外,构建了Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。     

芒果(Mangifera indica)黄烷酮3-羟化酶基因的克隆及其表达分析

色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因是花色素代谢途径上的关键酶,属于依赖型2-酮戊二酸的双加氧酶(2-ODD)家族,反应需要2-酮戊二酸、分子氧、铁和抗坏血酸,作用是催化柚皮素C3位羟基化,生成二氢山奈素(dhiydorkaempeforl,DHK)。本研究根据已经报道的F3H基因的序列设计兼并引物,采用RACE方法从芒果的果实中,克隆得到了一个F3H基因,其全长cDNA序列为1 182 bp,开放阅读框为1 092 bp,编码363个氨基酸,分子重量为40.82 k D,等电点为4.88。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测。对不同着色芒果品种中的F3H基因的表达进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。通过系统进化树分析发现芒果中黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因编码的蛋白与荔枝、可可、柚子等植物的亲缘关系比较近。     

‘红颜’草莓果实黄烷酮3-羟化酶基因克隆及表达分析

为探究八倍体‘红颜’草莓(Fragaria×ananassa Duch.)果实着色过程中的关键基因,本研究通过对前期果实表皮部位RNA-Seq数据的研究,筛选花色素苷合成途径的差异表达基因黄烷酮3-羟化酶基因(Flavanone 3-hydroxylase)。根据‘红颜’草莓F3H基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆F3H核苷酸序列,命名为FaF3H。将基因上传GenBank数据库获得八倍体‘红颜’草莓F3H基因登录号(MZ190021),并进行生物信息学分析。利用实时荧光定量方法分析草莓果实着色过程中该基因表达水平。结果显示,‘红颜’草莓FaF3H基因长度为1 095 bp,编码364个氨基酸。保守结构域分析显示,具有一个PLN02515超家族结构域。RT-qPCR结果表明FaF3H基因在草莓果实大绿期到白果期表达量下降,全红期表达量最高。FaF3H基因在草莓果实花色素苷合成过程中发挥重要作用。     

亚麻木质素合成关键酶基因表达分析

以亚麻(Linum usitatissimum)栽培品种白花为材料,采用半定量RT-PCR方法对亚麻木质素合成关键酶基因CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、F5H2和F5H3在不同组织及不同时期木质部、韧皮部的表达规律进行了研究。结果显示, 除F5H1在根部未表达外,其他基因在幼苗、根、花期木质部、花期韧皮部、叶、花和幼果中均有不同程度表达。CCoAOMT1在各部位都有较高的表达。2个4CL之间和3个F5H基因之间的部位表达的差异存在一定互补性。在韧皮部中,各基因均在幼嫩(30 d)阶段表达量最低;除4CL2在花期(60 d)达到表达高峰外,其他基因均在花后(70 d)表达量最高;4CL1在各时期均有较强表达,而F5H3在各时期弱表达。在木质部中,除4CL1在各时期均表达弱和F5H1在花前期为表达高峰外,其余基因均在幼嫩阶段表达量最高;随后逐渐降低,在花期后表达量大幅降低;与其他基因的明显区别在于各时期4CL1的表达量以韧皮部明显高于木质部。     

金花茶黄烷酮3-羟化酶基因CnF3H的克隆及表达分析

本研究利用反转录PCR和RACE方法,从中国珍稀濒危植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中获得了黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因的c DNA全长,命名为Cn F3H,Gen Bank登录号为HQ290517。碱基序列分析表明,该Cn F3H基因c DNA序列全长为1 360 bp,5'非翻译区(untranslated regions,UTR)长54 bp,3'UTR长202 bp,开放阅读框长为1 104 bp编码367个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,Cn F3H与茶(C.sinensis)F3H同源性高达99%。二级结构预测表明,无规则卷曲在Cn F3H蛋白结构中所占比例最大,其次为α-螺旋和延伸链。相对荧光定量PCR分析表明,Cn F3H基因的表达量在幼蕾期、初蕾期和膨大期的表达量较高,之后逐渐降低;Cn F3H基因在花器官不同部位中均有表达,其表达量高低顺序为雄蕊、花瓣、萼片、雌蕊和苞片。本研究为全面深入地研究金花茶花色形成的分子调控机理提供了充实的理论依据。     

绿色棉纤维类黄酮3',5'羟基化酶基因GhF3'5'H的克隆及实时定量表达分析

以发育18 d的天然绿色棉及其近等基因系白色棉纤维细胞为材料,利用cDNA-AFLP结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了1个绿色棉纤维优势表达基因的全长cDNA。序列分析结果表明,该cDNA全长1873bp,含有一个编码509个氨基酸残基的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个类黄酮3',5'羟基化酶,将该基因命名为GhF3'5'H,序列提交到GenBank,登录号为GU062184。实时荧光定量PCR检测结果显示:GhF3'5'H在绿色棉不同组织中的表达量均显著高于其近等基因系白色棉,而且主要在纤维细胞中表达。在纤维发育过程中,GhF3'5'H在纤维发育的早期表达量最高,并随纤维发育逐渐降低。推测该基因可能在绿色棉纤维色素前体物质的形成中发挥作用。     

向日葵PMADS2 LIKE基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因是调控花发育进程的关键转录因子。在向日葵中大量的花发育相关基因有待于发掘和鉴定。本研究以向日葵(Helianthus annuus)为材料克隆到了一个MADS-box新成员PMADS2 LIKE。序列分析结果显示该基因具有MADS-box家族典型的MIKC保守结构域;系统发育树分析发现该基因与拟南芥PI基因亲缘关系最近;q RT-PCR组织表达模式分析该基因仅在花和果实中表达,且在6个花器官中仅在雄蕊和花瓣表达;q RT-PCR定量分析表示该基因从开花前25 d一直表达到开花期,并且在开花前5 d表达量最高。研究结果表明,PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中具有一定的生物学功能。本研究的结果和推论为进一步探究向日葵PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中的生物学功能提供前期数据基础,为理清MADS-box基因在向日葵花发育中的调控网络提供线索。     

小麦花发育MADS-box基因的表达模式分析

为解析小麦花发育的分子机制,构建了MADS-box基因系统进化树,发现小麦中存在花发育ABCDE模型的各类基因。半定量RT-PCR和定量RT-PCR分析结果显示,A类基因AP1/FUL小麦中的同源基因TaFUL在所有花器官中都表达,在外稃和內稃中表达水平最高。B类基因TaAP3和C类基因TaAG的表达模式保守,TaAP3在浆片和雄蕊中表达,TaAG在雄蕊和雌蕊中表达。D类基因OsMADS13的同源基因除了在雌蕊表达外,在浆片也有较高的表达,暗示该基因可能同时影响胚珠和浆片的发育。E类基因TaSEP在内稃和内三轮器官表达,在外稃和护颖中不表达。LHS1是禾本科特有的MADS-box基因亚家族,发挥E类基因的功能。TaLHS1除了在內稃和外稃表达,在护颖中也有表达。水稻中控制心皮发育的DROOPING LEAF(DL)基因的同源基因TaDL除了在外稃和心皮表达外,在护颖中也有表达。根据这些结果,我们认为控制小麦花发育的分子机制比较保守,但部分基因功能在进化过程中可能发生了分化。另外,结合小麦外稃和护颖形态结构分析,TaLHS1以及TaDL的表达模式暗示小麦的护颖和外稃这两个器官可能有共同的起源。     

Genome-Wide Selection of MAPKKK Gene Family in Gossypium raimondii and the Expression of Orthologs in Gossypium hirsutum

[Objective] The MAPKKK gene family plays an important regulating role in response to multiple abiotic stresses and the development of plant. This study aims to identify MAPKKK genes of Gossypium raimondii and analyze their functions. [Method] In this study, based on G. raimondii genome database and bioinformatics method, G. raimondii MAPKKK family genes were identified and analyzed. Using the MEGA5, GSDS and Mapchart program, the phylogenetic tree, gene structure and chromosomes location analyses were accomplished. Based on the existing microarray data in cotton and comparative profiles of these MAPKKK genes, different expression of them in multiple abiotic stresses and the expression at different cotton fiber developmental stages were analyzed. [Result] A sum of 114 MAPKKK genes were identified systematically in G. raimondii and classified into 3 subfamilies (Raf, ZIK and MEKK) according to the gene stucture and phylogenetic tree analyses. They were distributed on all the 13 chromosomes of G. raimondii, and segmental duplication and tandem duplication events may have occurred. Compared with the recently released 78 genes of G. raimondii MAPKKK family genes, 47 sequences are exactly the same ones. [Conclusion] The results are helpful to understand the evolution and function of MAPKKK gene family. Our results provide a foundation for future functional characterizations of MAPKKK genes in cotton and probably other Gossypium plants.     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

‘月月粉’和野蔷薇花青素合成酶基因的鉴定与表达分析

植物花青素是一种天然的黄酮类水溶性植物色素,对于植物的花和果实的花色决定具有重要作用,花青素在植物体内的生物合成途径研究相对较清楚。但在蔷薇属植物中花青素合成酶基因的功能分析相对较少,通过序列比对和进化树分析鉴定‘月月粉’(Rosa chinensis‘Old Blush’,用OB表示)和野蔷薇(Rosa multiflora)中花青素合成酶基因各14个。通过序列比较发现野蔷薇和OB中对应的同源基因序列相似性很高,表明这些基因的保守性很强,但表达谱分析显示这些基因在两个物种中的差异较大,暗示其调控序列可能变异程度较大。通过检测一个野蔷薇自然突变单株中红花和白花中的花青素合成酶基因的表达,推测有部分花青素合成酶基因可能在花青素合成反馈调节中具有重要作用。通过分析启动子序列中顺式作用元件推测OB中花青素合成酶可能受蔗糖和不同激素的调控。本研究可为揭示蔷薇属植物花青素合成调控的分子机制提供依据。