猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定初报

采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。     

科苑荟萃

20050217表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定初报(韩雅婷,杨学义,徐小明等)表皮是一个可以持续自我更新的组织,表皮干细胞具有足够的增殖潜力,可产生一般哺乳动物机体所需的全部表皮。本试验采用酶消化法和组织块法对奶山羊、奶牛、猪、小鼠的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所得表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用Ⅳ型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化…     

山羊表皮干细胞分离纯化的研究

表皮干细胞(epidermalstemcells,ESCs)干细胞特性的维持是干细胞内在属性和微环境共同作用的结果,体外长期培养ESC的关键是维稳定的微环境。实验将组织块脱出的细胞经分次消化和型胶原快速贴附分离出表皮干细胞,在含20%条件培养基的无血清培养液进行培养。原代细胞表现K19阳性,并且能形成PGC集落样细胞团。从表皮和真皮组织中均可得到上皮样细胞,经纯化后均表现出明显的表皮干细胞特性:呈片状生长,铺路石样形态。将两类细胞分别传至5代和8代,后代细胞β1整合素染色呈阳性。对5代和8代细胞分别进行克隆分析实验,其克隆形成率分别为18.5%和8.5%。实验证明组织块法能够得到较好的维持ESC的微环境,所分离的ESC具有干细胞特性并能稳定传代。     

组织块法分离山羊表皮干细胞研究

采用组织块法从山羊耳部皮肤基底层分离表皮干细胞,并通过形态学观察、免疫组化染色以及克隆形成率等方法检测山羊表皮干细胞在DMEM/F12和F12两种不同培养体系中的体外生长特性。结果表明,DMEM/F12是一种适合表皮干细胞体外增殖培养的培养基,在此培养体系中细胞可传代至11代。     

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞。２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代培养的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２～３代后,可获得纯化的成纤维细胞。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。胎儿和皮肤成纤维细胞可分别传至第１３代与第１１代,传代后染色体数目不变。     

梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件优化

为开展目标蛋白质在梅花鹿耳成纤维细胞的功能研究提供理论和技术依据,培养梅花鹿耳成纤维细胞,优化脂质体转染梅花鹿耳成纤维细胞的条件,以获得最优质粒转染参数。采用组织块贴壁法和差速贴壁法分离梅花鹿耳成纤维细胞,观察细胞基本形态特征变化,免疫荧光法鉴定波形蛋白（Vimentin）的表达;以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为标记基因,利用LipofectamineTM 3000介导外源DNA转染梅花鹿耳成纤维细胞,探讨质粒DNA与脂质体比例（1.0∶1.0,1.0∶1.5,1.0∶2.0,1.0∶2.5,1.0∶3.0）、质粒用量（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5μg）、细胞传代次数（第2～6代）、细胞初始接种密度（50%,60%,70%,80%,90%）、转染效果观测时间（12,24,36,48,60 h）对转染效率的影响。结果表明：组织块贴壁法培养的梅花鹿耳成纤维细胞在倒置荧光显微镜下可见长梭形细胞生长,细胞免疫荧光检测波形蛋白（Vimentin）的表达结果为阳性;筛选的最佳转染条件：当质粒DNA与脂质体比例为1.0∶2.0,质粒DNA用量为1.5μg,细胞传代次数为第3代,细胞初...     

山羊成纤维细胞体外培养研究

分别采用组织块法与消化法对山羊耳成纤维细胞进行原代培养,比较两种方法的培养效果.结果表明,组织块法培养的细胞生长稳定,5～7d有细胞生长,15～18d长满单层;消化法培养的细胞,通过简化酶作用时间及用量的调控,可得到较为单一的成纤维细胞,且经过4～7d生长后能形成单层.同时对细胞培养过程中常遇到的污染问题及解决方法进行了探讨,为动物组织培养研究提供了实验依据.     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型,Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞,２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代增减２的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２－３代后,可获得纯化的成纤维细胞。     

体外培养山羊成纤维细胞系方法的建立

用山羊组织块和0.25%的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞,对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,则根据两者贴壁紧实程度不同,用0.05%的胰酶-EDTA进行不同时间的消化,将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后,进行冷冻解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明,在体外培养至20~30代成纤维细胞的细胞形态(为梭形细胞,高度汇合后呈火焰状)、细胞周期以及核型均为正常,符合体细胞克隆转基因的基本要求。     

SD大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定

为进一步简化、优化SD大鼠睾丸支持细胞的体外培养条件及鉴定方法,采用三酶两步消化法和差异贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞,并用HE染色、油红染色、Feulgen染色及透射电镜扫描其超微结构予以鉴定。结果表明：平均0．10g睾丸组织可获得2．5×10^6个支持细胞,细胞存活率90％以上,体外培养5h后开始贴壁,96h后细胞生长速率下降,其对数生长期为3—7d,整个体外生长周期约为10～15d。对获得的纯化细胞进行鉴定,发现其形态结构及超微结构与支持细胞的形态特征一致。可见,采用三酶两步消化法和差异贴壁法,可达到分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞的目的。     

鸽小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

本试验旨在建立鸽小肠上皮细胞体外分离培养和鉴定的方法体系,为研究鸽小肠上皮细胞的营养转运吸收、细胞增殖代谢等机制提供原代细胞模型.采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离鸽小肠上皮细胞,并通过相差消化法对其纯化,最后运用免疫荧光分析和基因表达分析鉴定鸽小肠上皮细胞.结果表明,2种方法均可成功分离培养鸽小肠上皮细胞,细胞呈铺路...     

新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

[目的]建立一种高效、实用的新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞原代培养方案,为肾脏损伤引起的疾病研究奠定基础.[方法]取5～8个月大的出栏细毛羊肾脏皮质,剪成1～2 mm3大小组块,分别采用传统组织块法和改良组织块法,在含15;～ 20;新生小牛血清的DMEM的培养基中进行原代培养,无需研磨或使用酶和化学试剂,根据上皮细胞自身的生长特性,首次结合刮除法,相差消化法和差速贴壁法,分离纯化上皮细胞,再选用0.037 mm孔径网筛过滤除去肾小球上皮细胞,分离纯化培养肾小管上皮细胞,细胞免疫组化进行鉴定.[结果]改良方法与传统方法相比,细胞贴壁早,生长快,处理时间短,减少了污染机率,提高了细胞培养效率,分离培养的肾小管上皮细胞,纯度达90;以上,细胞呈多角形,鹅卵石状,折光性强,连接紧密,可传至第9代,免疫细胞化学(CK - 18)染色鉴定为阳性.[结论]改良的组织块培养与传统的组织块培养以及常用的酶消化培养相比,经济、简单、不易污染,分离培养的肾小管上皮细胞,活性高,纯度高,是一种高效、实用的细毛羊肾小管上皮细胞培养方法.     

王鸽脑神经细胞原代分离培养与纯化的研究

研究采用7～8日胚龄的王鸽脑组织,采用胰蛋白酶消化法制备神经细胞悬液,接种于包被多聚赖氨酸的6孔培养板中培养,用阿糖胞苷抑制非神经细胞的生长,以寻求一种简单、可行的原代王鸽脑神经细胞培养方法。结果表明,试验成功地进行了原代王鸽脑神经细胞培养、纯化,并保证有足够数量的神经元存活,证明酶消化法原代培养王鸽脑神经细胞是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。     

牦牛子宫内膜腺上皮细胞分离培养方法比较

[目的]建立牦牛子宫内膜腺上皮细胞体外分离培养方法。[方法]分别采用组织块培养法和消化培养法分离、纯化牦牛子宫内膜腺上皮细胞。[结果]组织块培养约8d细胞可汇合成片,经胰蛋白酶分次消化,可得到纯化的子宫内膜上皮细胞;使用2g／L的胶原酶Ⅱ消化2．5h,更换新鲜消化液继续消化2．5h,消化悬液经74斗“滤网过滤,400r／rain离心5min,收集沉淀,重悬后自然沉降,可得到纯净的腺细胞团。免疫细胞化学显示所得细胞角蛋白染色阳性,阳性率达到95％以上。[结论]2种方法均可得到纯净的牦牛子宫内膜上皮细胞。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

【目的】探索一种简单且高效的原代奶牛乳腺上皮细胞的培养方法。【方法】采用组织块培养法、酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞;通过MTT法检测吸光度绘制细胞生长曲线;通过免疫组化法鉴定角蛋白-18的表达。【结果】酶消化法相比组织块培养法获得的细胞具有耗时短,获得量高等优点,MTT法绘制的生长曲线符合一般生物学特性,呈"S"型,奶牛乳腺上皮细胞中角蛋白-18阳性表达。【结论】酶消化法是一种简单且高效的培养原代奶牛乳腺上皮细胞的方法。     

Vertical Migrating and Cluster Analysis of Soil Mesofauna at Dongying Halophytes Garden in Yellow River Delta

For the first time,we used Tullgren method made a study on vertical migrating and cluster analysis of the soil mesofauna in Dongying Halophytes Garden in the Yellow River Delta(YRD),Shandong Province.The results showed that the soil mesofauna tended to gather on soil surface in most samples at most times,but the vertical migrating greatly varied in different seasons or environment conditions.Acari was the dominant group.The index of diversity of the soil fauna was correlated with the index of evenness.The Acari’s number of individuals infected other species and numbers.Dominant group-Acari made greater contribution to the result of cluster analysis,and there were significant differences between communities in different habitats by cluster analysis with both Bray-Curtis and Jaccard similarity coefficient.     

Cu~(2+)对栉孔扇贝外套膜组织培养的影响

[目的]了解重金属对栉孔扇贝的毒理效应。[方法]在DMEM培养液中分别添加质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.40 mg/L的Cu2+,以细胞迁出时间和组织块增殖状况为评价指标,研究Cu2+对栉孔扇贝外套膜组织培养的影响。[结果]栉孔扇贝外套膜在DMEM培养液中贴壁良好。培养至72 h时,Cu2+质量浓度为0.05 mg/L的实验组有游离细胞迁出,且组织块增殖情况良好。培养至89 h时,Cu2+质量浓度为0.10 mg/L的实验组有游离细胞迁出,且组织块增殖情况较差。随着Cu2+质量浓度的增大,细胞迁出所需的时间越长,组织块增殖情况越差。Cu2+质量浓度为0.40 mg/L的实验组,培养96 h时并没有游离细胞迁出。[结论]Cu2+质量浓度大于0.10 mg/L时对栉孔扇贝外套膜的组织培养有一定的抑制作用。