低温胁迫诱导斑马鱼ZF4细胞ROS及MAPK相关蛋白表达的影响

为了研究鱼类低温下分子调控机制及其与活性氧(reactive oxygen species,ROS)之间的关系,本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维ZF4细胞进行不同程度的低温胁迫(18℃和10℃),监测其在不同低温胁迫时间下(1 d、3 d和5 d)ROS的变化以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中蛋白的表达情况。结果显示:(1)DCFH-DA探针法表明在低温胁迫作用下,细胞内ROS含量增加。细胞内ROS上升水平与外界胁迫压力成正相关。低温处理3 d后,18℃和10℃的细胞,其ROS含量与对照组(28℃)相比分别显著升高到(1.23±0.04)倍(P0.05)和(2.31±0.08)倍(P0.05)。(2)Western Blot检测磷酸化的p38(p-p38)和磷酸化的JNK(p-JNK p54和p-JNK p46)的水平变化,结果显示低温胁迫可以使p38和JNK的活性增强,且均在10℃处理3 d达到最高水平。(3)进一步检测DNA断裂标记蛋白γH2A.X的表达水平,结果显示,无论在18℃还是10℃,其在第3天呈现高表达。本实验初步证实低温胁迫能够诱导斑马鱼细胞ROS的产生;通过对不同时间点的蛋白表达水平检测,发现p-JNK、p-p38和γH2A.X激活时间点与低温诱导ROS表达时间点相吻合。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定基础,其中低温下处理3 d可以作为一个检测各个蛋白变化的关键时间点。     

低温对罗非鱼基因组DNA甲基化的影响

以经过连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼耐寒品系为实验材料,采用DNA甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析方法从全基因组水平上探讨了低温适应对罗非鱼DNA序列中CCGG位点的甲基化水平的影响。结果显示,选用的18对选择性扩增引物共检测到849个位点。耐寒品系检测到的位点数为411个,对照组为438个,其中发生甲基化的位点数分别为72和104个,总甲基化率分别为17.52%和23.74%;全甲基化位点分别为37个和65个,全甲基化率分别为9.00%和14.84%;半甲基化位点分别为35个和39个,半甲基化率分别为8.52%和8.90%。结果分析表明,尼罗罗非鱼耐寒品系的总甲基化水平、全甲基化水平和半甲基化水平较对照组均有一定程度的下降。与对照组相比,尼罗罗非鱼耐寒品系基因组DNA甲基化总体水平下降了6.22%,其中以全甲基化位点变异为主,其下降幅度比例明显,为5.84%。由此可见,经过连续多代的低温胁迫可导致尼罗罗非鱼DNA甲基化水平发生改变,发生了去甲基化反应,表现为基因组甲基化程度降低的特征,说明了DNA甲基化与罗非鱼抗寒性反应密切相关。     

dusp1敲降对低温诱导斑马鱼ZF4细胞凋亡的作用

为了研究双特异性磷酸酶(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)基因与鱼类低温诱导的细胞凋亡之间的关系,本研究经Eco RI和Age1酶切构建plko.1-dusp1-sh RNA1,plko.1-dusp1-shRNA2,plko.1-negative control(nc),plko.1-EGFP的重组质粒,并分别与慢病毒包装质粒pCMV-DR8.9.1、pCMV-VSVG共同转染至293T细胞中,经293T细胞包装的病毒,感染斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维样细胞(zebrafish embryos fibroblast like cell line,ZF4),RT-PCR检测表明dusp1成功被敲降。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系,将细胞于28℃培养(正常对照组)或经10℃低温处理10 d,使用annexin V-FITC/Propidium lodide(PI)双色标记流式细胞术检测ZF4细胞凋亡情况。结果显示:低温胁迫下dusp1敲降的细胞凋亡(dusp1-shRNA1敲降,dusp1-kd1;dusp1-shRNA2敲降,dusp1-kd2)比例较nc组显著上调,其中早期凋亡和晚期凋亡细胞比例dusp1-kd1显著高于nc组,并且dusp1-kd1活细胞数显著低于nc组(P0.05),进一步证明dusp1参与鱼类冷应激过程,并在低温情况下保护细胞。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定了基础,其中dusp1基因沉默型斑马鱼细胞在10℃低温处理10 d凋亡数显著大于对照组,证明dusp1在细胞凋亡信号通路中起到重要调控作用,为低温下研究斑马鱼基因的分子机制提供新的思路。     

低温驯化下斑马鱼LINE1的表达检测

长散布核元件-1(Long spread nuclear element-1,LINE1)是跳跃基因。前期比较基因组研究发现,南极鱼经历漫长的低温适应进化后,与南极圈外的同亚目鱼类相比较,在基因水平上LINE1的扩增效率高达8~300倍,但LINE1的扩增与鱼类抵御寒冷之间的关系尚未明了。本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维细胞ZF4进行了不同时间梯度的低温处理(18℃、5 d和18℃、30 d),同时对斑马鱼成鱼也进行了不同时间的低温处理(10℃,3 h、6 h、1 d、3 d、5 d)。采用RT-qPCR检测了LINE1的mRNA水平,并克隆了斑马鱼LINE1基因启动子区,利用Luciferase双荧光报告系统,在ZF4细胞中验证LINE15’UTR在低温压力下的生物活性。结果显示,短时间低温处理下,ZF4细胞中LINE1 mRNA水平有所降低,而在长时间低温处理中,LINE1的mRNA水平显著升高。在成鱼中,短时间低温处理下,LINE1 mRNA水平降低;长期低温处理下,LINE1 mRNA水平显著升高。在ZF4细胞中发现,LINE15’UTR具有生物活性。在低温处理(18℃,3 d)下,报告基因信号减弱,间接表明LINE1启动子活性减弱。研究结果表明,低温压力会影响LINE1在鱼类中的表达。本研究为进一步探究LINE1在鱼类适应低温环境中的作用机制奠定了基础。     

低温压力对ZF4细胞组蛋白修饰的影响

为探索低温压力对斑马鱼细胞组蛋白修饰的影响,建立并优化使用斑马鱼(Danio rerio)成纤维细胞ZF4进行染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)的条件。本研究分别优化了ChIP过程中裂解细胞所使用的NP-40浓度、超声破碎的时间,确定了最佳NP-40浓度为0.2%,超声时间为20 min。利用针对β-actin启动子区域的引物,通过常规PCR初步验证ChIP实验是否成功。琼脂糖凝胶电泳结果显示, IgG组常规PCR产物基本无条带,H3K27me3组条带较暗, H3K4me3和H3K27ac组有较亮条带,初步说明实验可靠。使用正常培养(28℃)与长期低温驯化(18℃, 30 d)的斑马鱼成纤维细胞ZF4作为实验材料,通过优化之后的ChIP技术进行实验。分别使用qPCR和ChIP-qPCR检测低温驯化对肿瘤坏死因子b(tumor necrosis factor b,tnfb)基因表达以及其启动子区域H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3的影响。qPCR结果显示tnfb基因经过低温驯化后上调,而ChIP-qPCR结果显示,tnfb基因启动子区域的H3K4me3、H3K27ac富集度也出现升高, H3K27me3没有明显变化,提示低温压力可能通过影响tnfb基因启动子区域的H3K4me3、H3K27ac水平来调控tnfb基因的表达。本研究建立并优化的ChIP实验条件可以用来研究ZF4细胞组蛋白修饰变化,为下一步探索低温压力对斑马鱼细胞全基因组组蛋白修饰的影响奠定基础。     

硝基苯对斑马鱼细胞DNA的损伤

硝基苯是重要的人造化工原料,人类的生产和生活使其可能成为水体和环境的污染源。为了解硝基苯对水产动物可能的致毒作用,采用单细胞凝胶电泳（SCGE）方法检测了不同浓度硝基苯染毒后的斑马鱼肝胰脏、肾脏、鳍条表皮和精子细胞DNA的损伤情况。当硝基苯的处理剂量在国家地表水环境质量标准（GB3838-2002）时（0.017 mg/L）,对斑马鱼肝胰脏、肾脏和精子细胞DNA的损伤不明显,分别为30%、33%和44%,与对照组相比差异不显著（P>0.05）;在同样浓度下,鳍条表皮细胞DNA受损率则高达69%。当硝基苯的浓度高于国家地表水环境质量标准时,可引起斑马鱼肝胰脏、肾脏、鳍条表皮和精子细胞DNA的严重损伤。处理剂量为0.106 mg/L时,其受损率分别为48%、62%、61%、82%;0.213 mg/L时分别为42%、87%、76%、56%;在0.425 mg/L时分别为52%、87%、75%、75%;在0.850 mg/L时分别为58%、95%、93%、85%;在1.700 mg/L时分别为62%、90%、99%、83%,以上各处理组与空白对照相比差异显著（P<0.05）。实验结果表明,当水环境中硝基苯的浓度低于国家地表水环境质量标准时,对斑马鱼的体细胞及精子细胞没有明显的毒性作用;硝基苯的浓度高于国家地表水环境质量标准时,对斑马鱼体细胞和精子细胞具有较强的毒害作用,且细胞DNA的受损率随着硝基苯剂量的增加而增加,并呈现一定的剂量损伤效应。因此,渔业水质标准中硝基苯的浓度不应高于国家地表水环境质量标准。     

干露胁迫对长牡蛎基因组DNA甲基化的影响

为探讨干露胁迫对海产贝类基因组DNA甲基化的影响,应用荧光标记甲基化敏感扩增多态性(fluorescencelabeled methylation sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)技术,比较了不同干露条件下(0 d、0.5 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d和11 d)长牡蛎(Crassostrea gigas)基因组DNA甲基化的变化。结果表明,对照组(干露处理0 d)闭壳肌与鳃组织的总体甲基化水平分别为29.76%和29.82%;干露处理0.5 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d和11 d的长牡蛎全基因组甲基化水平呈现先增高后降低的趋势,其中,闭壳肌组织的总体甲基化水平分别为36.59%、38.86%、43.02%、39.30%、51.13%、46.79%和35.06%,鳃组织总体甲基化水平分别为39.39%、42.13%、39.36%、43.54%、56.19%、38.57%和28.99%;干露处理7 d的长牡蛎甲基化水平明显高于其他时期(P0.05),11 d时甲基化水平基本恢复至初始状态。甲基化变异模式分析发现,闭壳肌与鳃组织DNA甲基化变异位点存在差异,甲基化升高位点变化程度较大(P0.05)。以上结果表明,长牡蛎通过改变DNA甲基化模式来应答干露胁迫,发生了不同程度的甲基化与去甲基化反应,DNA甲基化与长牡蛎的抗逆性状密切相关。     

盐碱水环境对脊尾白虾基因组DNA甲基化的影响

为探讨盐碱水环境对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)基因组DNA甲基化的影响,本研究利用MethylRAD-Seq技术探究了长期盐碱水养殖组(SAS)和正常海水养殖对照组(SW)脊尾白虾鳃组织中的DNA甲基化水平,并对关键通路和基因进行了差异表达分析。结果显示,脊尾白虾鳃组织基因组中CG和CWG位点(W=A或T)分别检测到2 347 003和416 176处甲基化,甲基化普遍存在于基因组的基因间区和内含子区域,共筛选到8805个(8189个CG-DMSs和616个CWG-DMSs)差异甲基化位点,盐碱水环境下DNA甲基化水平略有增强。通过KEGG富集分析发现,DMS所在差异表达基因显著富集在HIF-1信号通路和剪接体通路,通路中hif-p、hk和sf3b1等关键基因在脊尾白虾盐碱水环境适应中可能发挥着重要作用;对SW和SAS组差异甲基化基因(DMG)进行筛选,得到158个CG-DMGs和94个CWG-DMGs,其中,富集到脂质代谢和囊泡介导的转运通路中的DMG最多;此外,有一些DNA甲基化位点与基因表达呈负相关,表明DNA甲基化与基因调控之间存在复杂的联系,大部分基因组DNA甲基化对基因表达有正调控效应。本研究结果首次分析了在盐碱水环境下脊尾白虾鳃组织的DNA甲基化水平特征,为解析甲壳类盐碱水环境适应机制提供了基础信息。     

刺参基因组DNA甲基化水平及模式对温度变化的响应

本研究为了探讨刺参(Apostichopus japonicus)在不同温度胁迫下的DNA甲基化水平与甲基化模式变化,利用全基因组重亚硫酸盐测序技术(WGBS)和酶联免疫吸附法(ELISA)对刺参在3个温度下(20℃、26℃和32℃)的纵肌、呼吸树、消化道和体壁4个组织进行分析.WGBS测序结果显示,在消化道组织中,2...     

刺参响应灿烂弧菌侵染的基因组DNA甲基化水平和转录组差异及其关联分析

为探讨病原菌胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异,本研究采用人工攻毒侵染胁迫,获得刺参化皮体壁组织,并以未攻毒组的健康体壁组织为对照,对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序,解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异,筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时,通过基因组甲基化和转录组联合分析,筛选负相关关联基因,为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示,刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%,侵染组甲基化水平显著升高;在发生甲基化的位点中,攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%,mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出差异甲基化区域(DMRs) 626 677个,注释到23 706个功能基因。转录组测序共检测到29 290个基因,筛选到差异表达基因496个,其中,上调基因214个,下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中,筛选到180个负相关关联基因,其中,差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析,筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供数据,也为刺参抗病性状选育提供科学参考。     

纳米ZnO和常规ZnO、ZnSO4对斑马鱼毒性效应的比较

为比较纳米ZnO、常规ZnO和ZnSO_4对斑马鱼氧化应激毒性的强弱,探究纳米ZnO的毒性作用与其释放的Zn2+和本身特性的关系,研究了纳米ZnO、常规ZnO、ZnSO_4对斑马鱼肝脏、肠、鳃组织中抗氧化酶活性及炎症凋亡基因表达的影响。实验将斑马鱼分别暴露于纳米ZnO、常规ZnO、ZnSO_4水体中,在4、24和96 h后,用分光光度法检测斑马鱼肝脏、肠、鳃中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、活性氧自由基(ROS)的变化;采用荧光定量PCR技术,测定实验组中肝脏、肠和鳃中Bax、Bcl-2、TNF-α及IL-6的mRNA相对表达量。结果显示,纳米ZnO、常规ZnO、ZnSO_4均引起斑马鱼各组织的氧化应激反应,且使组织中凋亡基因和炎症基因表达水平发生变化,激活生物体内的细胞坏死和细胞凋亡途径,引起细胞死亡或机体炎症,其中纳米ZnO的致氧化损伤作用最强。研究表明,纳米ZnO对斑马鱼的氧化应激毒性强于常规ZnO和ZnSO_4,而纳米颗粒本身特性是导致纳米ZnO毒性作用的主要原因。     

环境污染物对斑马鱼早期胚胎转座子转录活性的影响

转座子在生物基因组中占据重要的组成部分,是基因组中可移动和扩展的重要元件,其转座活性受外界环境因子调控。为了探讨环境应激对基因组转座子表达活性的影响,用环境污染物二噁英(TCDD)和重金属Cu~(2+)或Cd~(2+)处理斑马鱼早期胚胎,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)比较处理前后9种结构完整的转座子转录活性变化,这9种转座子分别是DNA转座子Tc1家族的Tc-a、Tc-b、Tc-c、Tc-d、Tc-e,反转录转座子病毒家族ZB-ERV-1、ZB-ERV-2、反转录转座子LINE家族L1-323和L1-21。结果发现,TCDD使8个转座子转录活性明显下调,1个转座子显著上调;Cu~(2+)导致7个转座子上调,2个显著下调;Cd~(2+)导致6个转座子上调,3个显著下调。研究表明,斑马鱼转座子转录活性受环境因素影响显著,环境胁迫可能是转座子活性变化的原因之一。本研究对了解和评估环境因子对鱼类转座子活性的影响作用具有重要的意义,为进一步研究生物基因组的进化机制提供参考。     

中国七种水生动物源无乳链球菌的分子特征及其对斑马鱼的致病性

为了解中国水生动物源无乳链球菌的分子流行特征,揭示其传播和流行规律,本实验对分离得到并鉴定的10株7种水生动物源无乳链球菌通过分子血清型、多位点序列分型(MLST)分型、毒力基因型和前噬菌体分型等方法进行分子分型;其次,通过斑马鱼评价7种水生动物源无乳链球菌的致病性。分子血清型分析结果表明,10株无乳链球菌可分为3种血清型,即Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型;MLST分型结果表明,Ⅰa型无乳链球菌均为ST7型,Ⅰb无乳链球菌均是ST261型,只有Ⅲ型无乳链球菌是ST739型。进一步分型结果表明,10株无乳链球菌可分为3种毒力基因型和4种前噬菌体基因型。根据4种分型结果可知,10株水生动物源无乳链球菌可分为4种类型,其中虎纹蛙源无乳链球菌具有独立的分子血清型、MLST型、毒力基因型和前噬菌体基因型,即Ⅲ-ST739-V1-P3;罗非鱼源无乳链球菌的基因型有3种,即Ⅰa-ST7-V2-P1、Ⅰa-ST7-V2-P2和Ⅰa-ST7-V3-P4;红尾皇冠鱼、鳙和罗非鱼源无乳链球菌的基因型相同:Ⅰa-ST7-V2-P2;卵形鲳鲹、宝石鲈和罗非鱼源无乳链球菌具有相同的基因型:Ⅰa-ST7-V2-P1;鲮和罗非鱼源无乳链球菌的基因型相同,即Ⅰb-ST261-V3-P4。致病性研究表明,7种水生动物源无乳链球菌对斑马鱼均有强致病性。研究表明,两栖类虎纹蛙源无乳链球菌和鱼源无乳链球菌的基因型明显不同,它们之间遗传变异较大,因此,无乳链球菌在两栖类和鱼类之间相互传播的可能性较小。鱼源无乳链球菌有3种基因型,且这3种基因型均在罗非鱼中流行,这表明无乳链球菌在鱼类中相互传播的可能性较大,尤其是在罗非鱼与其他鱼类之间。     

长牡蛎Htatip2的表达及其在不育三倍体雌性中的DNA甲基化

为探究DNA甲基化在长牡蛎性腺发育中的表观遗传调控机制,对长牡蛎Htatip2的同源性、系统进化、组织表达以及三倍体性腺可育型和不育型不同发育时期的基因表达和DNA甲基化谱进行了研究。结果显示,长牡蛎Htatip2的保守结构域与美洲牡蛎的Htatip2-like的保守结构域同源性最高。qPCR分析显示, Htatip2在各个组织中均有表达,其中在雌性性腺中的表达量最高。此外,该基因的表达量在可育型三倍体牡蛎性腺中随着性腺发育成熟而升高,在不育型三倍体牡蛎性腺中表达量变化不显著。BS-PCR分析显示,该基因的甲基化水平随着性腺发育成熟而降低,与基因表达水平成负相关性。双荧光素酶报告结果显示,甲基化的Htatip2启动子片段与未甲基化的片段相比,显著抑制了荧光素酶的活性。研究表明,长牡蛎Htatip2的DNA甲基化可能通过抑制基因表达参与了性腺成熟调控。本研究为表观遗传调控机制参与牡蛎性腺发育提供了重要参考依据。     

Evaluation of a 40 day Assay for Testing Endocrine Disrupters: Effects of an Anti-Estrogen and an Aromatase Inhibitor on Sex Ratio and Vitellogenin Concentrations in Juvenile Zebrafish (Danio rerio)

In the present study, the effects of the anti-estrogen ZM 189,156 and the aromatase inhibitor fadrozole were evaluated in a 40-day juvenile assay developed for screening of endocrine disrupting chemicals. Juvenile zebrafish were exposed from 20 to 60 days post hatch (dph) to ZM 189, 154 (100 μg l⁻¹ and 200 μg l⁻¹) and fadrozole (10, 32, and 100 μg l⁻¹). VTG concentrations were measured at 38 dph by the use of a direct non-competitive sandwich ELISA and sex ratios were determined at 60 dph by histological examination of the gonads. A small but significant increase in VTG concentrations was observed in fish exposed to ZM 189, 156 (100 and 200 μg l⁻¹) and fadrozole (10 and 100 μg l⁻¹) compared to control groups. In fish exposed to ZM 189, 156 and fadrozole, the percentage of females declined and the number of undifferentiated fish increased. These findings show that exposure of juvenile zebrafish to an aromatase inhibitor or an anti-estrogen during early development inhibits differentiation and development of female gonads. The data presented, furthermore, show that the 40-day juvenile assay may be suitable for screening endocrine disrupting chemicals acting as anti-estrogens and aromatase inhibitors.     

三疣梭子蟹甲基转移酶2基因克隆及在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

本研究采用SMART RACE方法克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Dnmt2(Pt Dnmt2)基因。该基因c DNA全长为1291 bp,开放阅读框为1203 bp,编码400个氨基酸。结构域分析显示,PtDnmt2基因有典型的C5-DNA甲基化酶结构域。同源分析表明,PtDnmt2氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。系统进化分析显示,三疣梭子蟹PtDnmt2氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Dnmt2关系最近。qRT-PCR结果显示,PtDnmt2基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量显著高于其他组织(P0.05)。PtDnmt2基因在胚胎和幼体发育过程中的表达量随发育时期而变化,其在受精卵和多细胞时期无表达,从囊胚期开始出现,随着胚胎的发育表达量逐渐上升。在性腺发育不同时期PtDnmt2基因表达量存在显著差异,其在卵巢II期表达量最高,之后逐渐下降;在精巢中该基因的表达量随着精巢的发育逐渐上升,在IV期达到峰值。本研究结果表明,PtDnmt2基因参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控。