17β-雌二醇上调绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-2(SBD-2)表达的可能信号通路研究

【目的】探讨17β-雌二醇(E2)上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2表达的可能信号通路。【方法】分离培养绵羊输卵管上皮细胞,将第2代输卵管上皮细胞分为E2(10-8 mol/L)组、雌激素受体拮抗剂ICI182780(10-7mol/L)组、PKA阻断剂KT-5720(1μmol/L)组、PKC阻断剂H-7(50μmol/L)组、NF-κB阻断剂PDTC(50μmol/L)组及空白对照(Control)组,在不同阻断剂组加入各自阻断剂干预绵羊输卵管上皮细胞1h后,在各阻断剂组和E2组中再加入10-8 mol/L 17β-雌二醇培养6h,然后采用实时荧光定量RT-PCR方法检测各组SBD-2mRNA表达水平的变化。【结果】10-8 mol/L 17β-雌二醇可显著上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2mRNA的表达(P<0.05);雌激素受体拮抗剂ICI182780、NF-κΒ阻断剂PDTC、PKC阻断剂H-7均可阻断17β-雌二醇对SBD-2的上调作用,PKA阻断剂KT-5720对17β-雌二醇介导的SBD-2上调无明显影响。【结论】17β-雌二醇上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2的表达由雌激素核受体、NF-κΒ、PKC信号转导通路所介导,而PKA不参与17β-雌二醇对SBD-2的上调作用。     

酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)基因表达的影响

【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的调节作用,为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新鲜的绵羊瘤胃组织用PBS和抗生素处理后进行瘤胃上皮细胞原代培养,当原代细胞数量长到细胞培养瓶的85%以上时,将细胞传于12孔板用于细胞刺激试验。同时将活化并纯化后的酿酒酵母菌25℃、180 r/min有氧培养48 h后,进行5次平行平板计数试验,根据平板计数的数据处理方法,得到浓度为5.2×108CFU·m L-1的酿酒酵母菌液,再通过倍比稀释把所得菌液依次稀释成浓度为5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU·m L-1的菌液,用以上不同浓度(5.2×104—5.2×108CFU·m L-1)的酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞分别进行不同时间(2、4、8、12、24 h)的刺激,并设置对照组用DMEM/F12培养基代替酿酒酵母菌。然后提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测瘤胃上皮细胞中SBD-1表达差异。最后用SAS 9.2软件对数据进行相关差异性分析。【结果】荧光定量PCR结果表明,在各时间组内SBD-1 m RNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1时表达量达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 m RNA的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势,刺激时间为12 h时SBD-1 m RNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU·m L-1的菌液刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P0.01)。ELISA检测结果显示,SBD-1蛋白表达趋势与SBD-1 m RNA检测结果基本一致。不同浓度的菌液分别刺激绵羊瘤胃上皮细胞2、4、8、12、24 h后均能提高共培养上清中SBD-1蛋白的表达,且与对照组相比存在极显著差异(P0.01)。在菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高,与此浓度下各时间组相比差异极显著(P0.01)。【结论】酿酒酵母菌能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1的表达量达到最高。     

LPS注射后小鼠乳腺中β-防御素1 mRNA表达的变化

为了研究β-防御素1(β-defensin 1,Defb1)基因在小鼠乳腺发生炎症反应时的表达变化,本试验以小鼠第4对乳腺组织为研究对象,用LPS诱导小鼠乳腺组织发生炎症,半定量RT-PCR法研究了小鼠乳腺中Defb1 mRNA表达的相对丰度。试验结果表明,与对照组相比,LPS诱导后各时期Defb1基因的表达量均显著增加(P<0.05),9 h时达到最高峰。     

鸡β- 防御素7 的克隆及表达

以NCBI已登录的鸡β-防御素7(登录号:NM_001001194)为模板,设计特异性引物,扩增鸡β-防御素7基因,目的基因与pET32a载体相连,构建表达质粒并导入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和抗菌试验。结果表明,PCR扩增的目的片段,经测序证明与鸡β-防御素7基因NM_001001194序列同源性达99%,经IPTG诱导表达的重组蛋白与预期大小相符。平板抑菌试验结果表明,该重组多肽对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌活性。     

β-防御素研究进展

β-防御素在黏膜上皮细胞广泛表达,在先天免疫系统中扮演重要角色。因具有独特的抗菌机制和广谱抗细菌、抗真菌、抗病毒活性。极难产生抗药性而日益受到人们的关注。就β-防御素的分子特征、生物学活性、抗菌机理、基因重组表达,目前科研中存在的问题及其应用前景做了综述,为临床医学提供参考。     

猪β防御素-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建标记基因可去除的β防御素-1(pBD-1)基因乳腺特异性表达载体,利用RT-PCR方法从猪脾脏中克隆获得pBD-1基因,再插入乳腺特异性表达骨架载体pBC1-neo中;经PCR、酶切电泳以及测序鉴定,确认成功构建出乳腺特异性表达pBD-1的载体。进一步将上述功能片段亚克隆至能将标记基因全部去除的骨架载体MCS-3s-loxP-GFP中,成功构建了一种筛选标记可全部去除的乳腺特异性3s-loxP-GFP-pBC1-pBD1转基因载体。该载体为研究pBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机制,以及创制乳腺高效表达pBD-1的转基因猪育种新材料和通过哺乳以提高新生仔猪抗病力奠定了基础。     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

梅花鹿β-防御素-1(siBD-1)cDNA的克隆及序列分析

从梅花鹿的舌黏膜上皮组织中提取RNA,根据已获得的驯鹿β-防御素reBD-1基因序列设计并合成引物,采用RT-PCR技术进行梅花鹿β-防御素siBD-1基因的扩增,将获得的300bp的cDNA进行双向克隆及序列测定分析。结果表明所克隆出的cDNA为梅花鹿β-防御素siBD-1,该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF),编码64个氨基酸残基的前原防御素,该前原防御素含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。siBD-1 cDNA的获得为以后更好地研究梅花鹿黏膜防御机制奠定了基础。     

鸡β-防御素及其真核表达载体构建分析

本文介绍鸡β-防御素和研究现状,并对其真核表达栽体构建的可行性进行了可行性分析.     

鸡β-防御素-9的融合表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的探究重组禽β-防御素6 (AvBD6)、禽β-防御素9 (AvBD9)蛋白的原核表达及其生物学特性。方法将AvBD6和AvBD9成熟肽基因克隆到表达载体pGEX-6P-1上,进而将重组表达质粒转化到BL21(DE3)pLysS 感受态中,用IPTG进行诱导表达后对其进行纯化,SDS-PAGE电泳分析重组蛋白AvBD6和AvBD9的表达情况,继而检测其体外抗菌活性并用透射电镜观察细菌形态变化,检测重组蛋白对鸡红细胞的溶血活性。结果重组AvBD6和AvBD9蛋白诱导表达的分子量约为30 ku,且主要在上清中表达。2种重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性。电镜观察显示：菌体内容物外泄,损伤严重,并且重组蛋白对鸡红细胞无溶血活性。结论本研究制备的AvBD6和 AvBD9重组蛋白具有良好的生物安全性和抑菌效果,为进一步研究其抗菌机制及临床初步应用奠定了基础。     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达

对鸡β-防御索-3(Gal-3)在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究.以重组质粒CaJ-3-T为模板,利用PCR技术扩增出Gal-3基因成熟肽片段,将该片段插入到酵母表达载体pPICZα-C,构建分泌型重组表达载体pPICZα-C-Gal-3,电转入表达宿主菌X-33毕赤酵母,Zeocin抗性筛选重组菌株;挑取阳性菌株经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4.5 kDa位置出现预期条带;对所表达的Gal-3进行抗菌活性检测,发现其具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细黹的活性.     

黄沙鳖β-防御素基因克隆及其表达分析

[目的]明确β-防御素在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用,为开展黄沙鳖绿色病害防治及促进其养殖业健康发展打下基础.[方法]运用RACE克隆黄沙鳖β-防御素基因(Hs-BD1)cDNA序列,采用SignalP-5.0、PredictProtein、PSIPRED、Robetta和Clustal X等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测Hs-BD1基因在黄沙鳖不同组织中的表达特征及细菌感染前后的表达变化.[结果]Hs-BD1基因cDNA序列全长493 bp,包括72 bp的5'非编码区(5'-UTR)、201 bp的开放阅读框(ORF)及220 bp的3'非编码区(3'-UTR).Hs-BD1基因编码66个氨基酸残基,包括22个氨基酸残基组成的信号肽区、3个氨基酸残基组成的前肽区和41个氨基酸组成的成熟肽区.其中,成熟肽区具有6个保守的半胱氨酸残基(31Cys、58Cys、38Cys、52Cys、42Cys和59Cys)及位于C1和C2间的甘氨酸残基(Gly),即Hs-BD1基因属于β-防御素家族.Hs-BD1氨基酸序列与中华鳖β-防御素16的相似性最高(93.9%),基于β-防御素序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖和西部锦龟聚为一支,其亲缘关系相对较近.6个保守的半胱氨酸残基分别以C1-C5、C2-C4和C3-C6的连接方式形成3个二硫键;Hs-BD1成熟蛋白三级结构是由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成.Hs-BD1基因在黄沙鳖肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,在心脏、肠道、肌肉、脑组织和表皮中的相对表达量均较低;以温和气单胞菌攻毒后,Hs-BD1基因在黄沙鳖脾脏中的相对表达量呈上升—下降—上升—下降的变化趋势,在攻毒后第3和36 h共出现2个表达峰值,对应的相对表达量分别是攻毒前(0 h)的20.8和10.6倍,差异均极显著(P<0.01).[结论]Hs-BD1基因在黄沙鳖的多个组织中均有表达,尤其在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,且可被温和气单胞菌感染诱导表达,说明Hs-BD1基因在黄沙鳖抵抗病原感染的过程中发挥调控作用.     

山羊β-防御素蛋白的理化性质对其抗菌活性的影响

为了解山羊内在防御系统中发挥的重要作用,在山羊防御素保守序列的基础上设计了12条不同理化性质的防御素(DGBD1~12)基因,克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA的EcoR I和Not I酶切位点,构建重组表达载体pPICZαA-DGBD。经SaI线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经PCR鉴定阳性重组菌。经过摇瓶发酵和甲醇诱导,阳性重组菌的发酵上清液对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌等具有较强的抑制作用。最小抑菌浓度测定显示重组质粒对大肠杆菌的抑制作用最强。研究结果显示,疏水指数较高的序列DGBD1~DGBD3的抗菌活性较好,稳定指数较低的序列DGBD4~DGBD6抗菌活性仅次于疏水指数,说明DGBD结构稳定性和疏水性对其抗菌活性有较大影响。     

牦牛β-防御素5基因的原核表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因序列与黄牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。经IPTG诱导,获得了分子质量为25ku的牦牛β防御素-5成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散结果表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抗菌作用。【结论】牦牛BNBD5成熟肽在大肠杆菌中得到了成功表达,其产物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗性。     

小鼠乳腺组织中β防御素1基因的克隆及其在妊娠期和泌乳期乳腺中的表达变化

β-防御素具有广谱的抗菌活性,并且是宿主固有免疫的重要参与者。为研究β-防御素1(β-defensin 1,Defb1)基因在不同泌乳时期的表达变化,以小鼠第4对乳腺组织为研究对象,用半定量RT-PCR法测定了小鼠妊娠期、泌乳期乳腺中Defb1基因的表达。结果表明,妊娠期Defb1的表达量呈上升趋势,且差异显著(P<0.05),而泌乳期却恰恰相反,随着泌乳的进行,Defb1的表达量逐渐降低,在泌乳18d时达到最低。     

慢病毒介导稳定表达禽β-防御素9的 DF-1细胞系的建立及初步应用

【目的】为建立能够稳定表达禽β-防御素9(AvBD9)的DF-1细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性。【方法】将AvBD9基因克隆至慢病毒载体pLOV-eGFP中,将重组质粒与psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞,包装成含AvBD9基因的重组慢病毒,并将其感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素筛选和纯化,获得稳定表达AvBD9蛋白的DF-1细胞系。利用RT-PCR和Western blot验证AvBD9基因在DF-1中的转录和表达;将细胞培养上清液与耐药大肠杆菌混合培养,检测其抗菌效果,并用扫描电镜观察其对菌体的损伤情况。【结果】筛选出了稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,且AvBD9在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清使耐药大肠杆菌的存活率低于55%,电镜观察显示菌体皱缩,损伤严重。【结论】成功建立能够稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供了借鉴思路,为进一步开展AvBD9的抗菌研究提供依据。     

萨能奶山羊β-防御素-3基因的克隆、序列分析及差异表达

β-防御素-3(BD-3)基因在乳腺炎病程中有重要作用,目前尚未见有关山羊BD-3基因的研究报道,根据已发表的牛的BD-3基因序列的编码区(CDS)设计引物,经RT-PCR、连接T载体、挑取克隆和测序,成功克隆出长度为210bp的萨能奶山羊BD-3基因CDS区,并提交至GenBank。分析该CDS区的核苷酸和氨基酸序列,结果表明,所得核苷酸序列与牛、人的序列同源性分别为91.2%和80.9%;其氨基酸序列在萨能奶山羊BD-3蛋白的功能结构域(含23~67个氨基酸)与人的结构域同源性为99.9%,蛋白质三级结构相似。分别用热灭活的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、大肠杆菌对乳腺上皮细胞刺激0、2、4、6、8h,观察BD-3基因的mRNA水平变化,结果显示,金黄色葡萄球菌刺激4h后,BD-3表达量达到最高,与对照组相比差异极显著(P0.01);停乳链球菌刺激后,BD-3表达量持续升高,8h时与对照组差异极显著(P0.01);大肠杆菌刺激后,BD-3表达量逐渐升高,4h时达到最高,但与对照组差异不显著,之后表达量逐渐下降。成功克隆出山羊BD-3基因,并且在金黄色葡萄球菌、停乳链球菌的刺激下有较高水平的表达,说明BD-3基因在乳腺炎病程中起到重要作用,为乳腺炎的机理研究提供借鉴。     

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。     

鸡β-防御素Gal-3在转基因紫花苜蓿中的表达

【目的】在紫花苜蓿中表达鸡β-防御素3(Gal-3),为利用紫花苜蓿规模化生产Gal-3奠定基础。【方法】PCR扩增鸡Gal-3基因,以潮霉素作为转基因植物的选择标记,将鸡β-防御素Gal-3基因克隆至表达载体pCAM-BIA1390R(简写为p1390R)上,构建重组表达质粒p1390R-Gal-3;采用冻融法将质粒p1390R-Gal-3转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化至紫花苜蓿;采用PCR检测、Southern blot筛选阳性转基因苜蓿植株,并对Gal-3蛋白进行抑菌活性研究。【结果】PCR扩增获得了240bp的鸡Gal-3基因,成功构建植物表达载体p1390R-Gal-3,在苜蓿中初步建立了Gal-3的遗传转化体系,共获得22株转基因苜蓿植株,其中4株为阳性植株,转化率为18.2%。PCR扩增和Southern blot检测表明,Gal-3基因已整合到转基因苜蓿基因组中。提取转基因苜蓿的Gal-3蛋白进行抑菌活性试验,结果显示转基因苜蓿对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有抑制作用。【结论】获得了具有抑菌活性的转鸡β-防御素Gal-3基因的苜蓿植株。     

重组鸡β-防御素12蛋白的原核表达及其生物学特性分析

为探讨鸡β-防御素12（AvBD12）的生物学特性,试验采用RT-PCR方法从鸡脾脏组织中扩增到鸡AvBD12基因,其cDNA大小为198 bp,编码65个氨基酸。将该基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pProex HTa上,进行原核表达。Tricine-SDS-PAGE电泳表明,重组鸡AvBD12融合蛋白分子质量约为14 ku。对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定,结果显示,纯化后的重组鸡AvBD12融合蛋白对金黄色葡萄球菌和兔波氏杆菌有较高抗菌活性,对猪霍乱沙门氏菌和乳酸菌的抗菌活性较弱。高盐浓度对其抗菌活性有显著影响。该重组蛋白对鸡红细胞无显著溶血活性。荧光定量PCR结果表明,AvBD12基因在所测定的15个鸡组织器官中均有表达。