云南省六个水稻产区稻瘟病菌三个无毒基因的组成及其致病型

为明确水稻抗性基因Piz-t、Pib和Pii的有效性,利用无毒基因AvrPiz-t、AvrPib和Avr-Pii的特异性引物对自云南省6个水稻产区采集并分离获得的348株稻瘟病菌Magnaporthe oryzae菌株进行PCR扩增检测,并测定其对仅含Piz-t、Pib和Pii基因的水稻抗性单基因系IRBLzt-T、IRBLb-B和IRBLi-F5品种的致病性,明确这3个无毒基因在云南省水稻产区组成及分布。结果表明,在348株稻瘟病菌菌株中,分别有51.7%、46.8%和15.8%的菌株含有无毒基因AvrPiz-t、AvrPib和Avr-Pii,GT8、GT2、GT5、GT6、GT1、GT3、GT4和GT7基因型菌株检测频率分别为24.7%、21.8%、21.0%、16.7%、4.9%、4.0%、3.4%和3.4%;分别有4.9%、29.2%、41.1%和24.7%的菌株含有3、2、1和0个无毒基因;云南省稻瘟病菌群体总多样性指数水平较高,为2.81,其中滇中水稻产区的最高,为2.97;在348株稻瘟病菌菌株中,分别有89.1%、63.2%和38.5%的菌株对单基因系IRBLzt-T、...     

海南省田间稻瘟病菌中AvrPiz-t基因位点变异

为评估在水稻育种中被广泛利用的广谱抗稻瘟病基因Piz-t的有效性,对不同年份分离自海南省陵水黎族自治县和三亚市水稻的273株田间稻瘟病菌株中的AvrPiz-t位点变异及其与菌株致病性的相关性进行系统研究。结果表明,海南省田间菌株中无毒基因AvrPiz-t位点的变异频率为0～100.00%,陵水黎族自治县菌株中的变异频率远远高于三亚市菌株。在菌株中共鉴定到3种AvrPiz-t位点变异类型,分别为基因位点完全缺失、DNA重复元件MGR583在基因位点启动子区-10 bp上游和编码区218 bp下游插入。所有AvrPiz-t位点变异的菌株对携带Piz-t抗病基因的单基因水稻系IRBL-11均表现出强的致病性。陵水黎族自治县菌株中AvrPiz-t位点的变异频率呈逐年增加趋势,2021年94株菌株中AvrPiz-t位点的变异频率为100.00%,其中51.06%的菌株变异是MGR583在启动子区-10 bp上游插入,表明DNA重复元件MGR583在AvrPiz-t位点插入是AvrPiz-t从无毒到有毒进化的重要机制之一。     

云南省元阳县籼/粳型稻瘟病菌无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii多样性分析

为明确云南省元阳县籼/粳型稻瘟病菌中无毒基因的多样性及差异,采用接种鉴别品种方法和PCR技术对9株粳型菌株和21株籼型菌株中无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii的多样性进行分析。结果显示,30株稻瘟病菌菌株中无毒基因Avr-Pia、Avr-Pita1和Avr-Pii的平均出现频率分别为33.3%、76.7%和0,Avr-Pia、Avr-Pita1在籼型菌株和粳型菌株中的出现频率分别为4.8%和100.0%、66.7%和100.0%。Avr-Pia主要为存在/缺失的多样性,籼/粳型菌株对水稻品种Achiasahi(Pia)的致病率分别为100.0%和11.1%;Avr-Pita1可划分为3个类群,除菌株CH1195属于PO类群外,籼型菌株均属于J1类群,粳型菌株则属于J2/J3类群;籼/粳型菌株对水稻品种K1(Pita)的致病率分别为100.0%和0,且籼/粳型菌株Avr-Pita1蛋白序列在第83位和第192位氨基酸差异明显。Avr-Pii在30株稻瘟病菌菌株中均未检出,籼/粳型菌株对水稻品种Fujisaka No. 5(Pii)的致病率分别为100.0%和0。表明Avr-Pia和Avr-Pita1在粳型菌株中的出现频率高于籼型菌株且变异程度低,粳型菌株中可能存在其它无毒基因使其不能侵染Fujisaka No. 5。     

福建省稻瘟病菌致病性及其无毒基因分析

利用41个已知抗性基因水稻品种测定2003—2006年从福建省闽东、闽南、闽西、闽北和闽中5个主要稻区采集分离的87个稻瘟病单孢菌株的致病性。结果表明,福建省稻瘟病菌群体含有与所有测试抗病基因相应的无毒基因,其中66.67%的稻瘟病菌株表现较强致病力。病菌群体对水稻抗病基因Pi-d2、Pi-k(1)、Pi-km、Pi-kh、Pi-1(1)、Pi-z5(1)、Pi-z5(2)和Pi-1(2)的毒力频率均低于10%,提示这些抗病基因在福建省可作抗源使用。2003—2006年福建省稻瘟病菌群体中分别出现了40、37、36和38个无毒基因,其中有34个无毒基因在各年份均有分布,有30个无毒基因在5个主要稻区均有分布,Avr-a(2)、Avr-3(2)、Avr-ks、Avr-4b、Avr-b、Avr-kp(C)、Avr-km(C)、Avr-ta(C)、Avr-11(C)、Avr-19(t)、Avr-t和Avr-a(1)无毒基因的出现频率均低于30%,提示与之相对应的抗病基因在福建省水稻品种抗稻瘟病育种中应慎用。含有17、14、23、18和16个无毒基因组合的病菌较多,其组合频率分别为13.79%、10.34%、9.20%、8.05%和8.05%。     

南方稻区稻瘟病菌株中无毒基因AvrPi9的变异分析

 本研究通过PCR(Polymerase Chain Reaction)和测序技术以及稻瘟病菌致病力检测手段,分析了2020年来自安徽、重庆、福建、广西、湖南、江苏、江西、云南以及浙江等省(直辖市、自治区)的300个稻瘟病分离菌株的无毒基因AvrPi9的分布和变异情况。结果表明,298份稻瘟病菌分离菌株的AvrPi9位点能被有效扩增,扩增产物经测序分析后显示,其中8株供试菌株的AvrPi9基因位点的外显子区域253位发生单碱基变异(C碱基替换成T碱基,AvrPi9^C253T),导致转录提前终止。稻瘟病菌致病力分析表明,AvrPi9^C253T菌株对带有Pi9基因的植株TP309-Pi9产生了致病性,说明该类菌株的AvrPi9位点变异后不能被Pi9识别。上述结果提示培育和种植携带有抗稻瘟病基因Pi9的品种可以较大程度上对南方稻区稻瘟病起到防控作用。这对保障水稻生产安全具有重要意义。     

广东省不同稻区稻瘟病菌生理小种鉴定及无毒基因分析

为明确广东省不同稻区稻瘟病菌Magnaporthe oryzae生理小种与无毒基因的类型与分布,利用7个中国鉴别品种、11个抗稻瘟病单基因系及3个广东省优质抗源稻种三黄占2号、青六矮和珍桂矮,采用苗期喷雾接种方法对2018—2019年分别从广东省不同稻区感染稻瘟病的不同栽培稻品种上分离获得的368株稻瘟病菌单孢菌株进行生理小种鉴定与无毒基因分析。结果显示,利用中国鉴别品种共鉴定出 6 群 30 个生理小种,其中优势种群为 ZB 和 ZC,出现频率分别为 44.29% 和43.48%,优势生理小种为ZB13和ZC13,出现频率分别为26.90%和29.35%。利用11个水稻抗稻瘟病单基因系鉴定出测试菌株对含有Pi9、Pi1、Pik-h和Pi50这4个水稻抗稻瘟病单基因系的无毒性频率均大于80.00%;来自粤北、粤西和珠三角3个稻区的稻瘟病菌对抗源稻种三黄占2号的毒性频率低于11.76%,对珍桂矮的毒性频率大于69.41%。表明2018—2019年广东省稻瘟病菌群体生理小种结构复杂,多样性丰富,在粤北、粤西和珠三角稻区可利用的抗性基因一致,可推广使用含抗性基因Pi9、Pi50、Pik-h和Pi1的水稻品种;三黄占2号抗性好,抗谱较宽,可作为广东省抗稻瘟病种质资源加以利用。     

一个新的与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pikm紧密连锁的SCAR标记

 无毒基因是病原物中决定寄主抗病性表达的功能基因,其功能的丧失导致毒性小种的产生。本研究利用随机引物扩增DNA多态性技术,从稻瘟病菌菌株S1522中新筛选到1个与无毒基因AVR-Pik^m紧密连锁的DNA标记OPE12₁₄₀₀。根据OPE12₁₄₀₀的核苷酸序列,设计了1对含有17个核苷酸的特异性SCAR引物,并利用该引物对无毒表型亲本S1522和毒性表型亲本S159及其有性杂交后代的108个菌株进行了PCR扩增。结果表明:所有无毒表型的菌株均能特异性扩增出1条与OPE12₁₄₀₀大小相近的DNA片段,而毒性表型的菌株除2个重组体外,均不能扩增出此片段。根据计算,这一SCAR标记与目标无毒基因AVR-Pik^m之间的遗传距离为1.89 cM,与本研究小组先前报道的另一个标记OPO12₁₀₀₀位于目标基因的同一侧,但与OPO12₁₀₀₀相比,距目标基因近了2.86 cM。本标记的获得将有助于确定AVR-Pik^m在染色体上的位置,有助于确定用于进一步筛选位于相反一侧的连锁标记的重叠群区域。     

水稻品种抗稻瘟病分析及基因聚合抗性改良

为了解水稻品种抗瘟性及基因聚合改良的情况,通过喷雾和离体划伤接种法对黑龙江省20个水稻品种和16个外源抗瘟基因的抗性频率及6个主要水稻品种含有的抗瘟基因型进行了分析。结果表明,20个水稻品种抗性频率介于10.89%~68.32%之间,垦稻12抗性最低,龙粳40抗性最高;16个抗瘟基因抗性频率介于0~50.50%之间,Pi-sh、Pi-19和Pi-k~m基因抗性最低,Pi-z~t抗性最高;在联合抗病性方式下,龙粳40龙粳31和龙粳40龙稻14组合抗性改良效果略好;20个水稻品种的抗性相似系数介于0.24~0.75之间,在0.40水平上将其划分为5个类群;6个水稻品种共检测到抗瘟基因11个,Pi-1基因出现频率最高;在基因聚合方式下,龙粳39聚合后抗性最高,龙稻13聚合后抗性升幅最大。综合分析,供试水稻品种及单基因系品种抗性表现较差,基因聚合方式对水稻品种的抗性改良效果明显优于联合抗病性方式。     

稻瘟病菌无毒蛋白AvrPiz-t半胱氨酸残基的功能分析

 稻瘟病菌无毒基因AvrPiz-t编码了一个包含108个氨基酸的未知功能的预测分泌蛋白,其与对应的水稻抗稻瘟病基因Piz-t介导了基因对基因的抗病反应。序列分析发现AvrPiz-t的预测成熟蛋白AvrPiz-t₉₀含有4个半胱氨酸残基,推测它们可能参与了AvrPiz-t蛋白分子内或分子间的相互作用。为了检测这4个半胱氨酸对AvrPiz-t功能的影响,利用定点突变技术对4个半胱氨酸残基分别进行了位点突变并构建了相应的稻瘟病菌互补载体。功能互补分析发现,上述4个突变体都丧失了AvrPiz-t无毒基因的功能。由此推断,半胱氨酸对AvrPiz-t蛋白功能的表达是非常重要的。     

一个与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik~m连锁的SCAR标记的分离

 本研究将以前在稻瘟病菌菌株S1522获得的与决定对水稻品种梅雨明无毒性的基因(AVR-Pik^m)相连锁的1个RAPD标记OPO12₁₀₀₀进行了克隆和鉴定。核苷酸序列测定与分析结果表明:OPO12₁₀₀₀的大小为946个碱基,不含有与已报道的稻瘟病菌Mg-SINE、Fosburry、Magyy、Grasshopper、Pot2以及Pot3等同源的重复序列。根据OPO12₁₀₀₀的核苷酸序列,设计了1对24个核苷酸的特异引物,对无毒表型亲本S1522和毒性表型亲本S159、无毒表型群体基因池、毒性表型基因池以及有性杂交后代108个菌株进行了PCR扩增,所有无毒表型的菌株均能特异性地扩增出1条与OPO12₁₀₀₀大小相同的DNA条带,而毒性表型的菌株除5个重组个体外,均不能扩增出这条特异带。此结果表明,与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik^m连锁的RAPD标记OPO12₁₀₀₀被成功地转化为SCAR标记,为进一步通过染色体步移克隆该无毒基因奠定了基础。     

云南省稻瘟病菌群体的致病性分析及交配型分布

为明确云南省不同稻区稻瘟病菌Magnaporthe oryzae的毒性频率及交配型分布,利用2007—2013年分离自云南省不同稻区的112株稻瘟病菌单孢菌株,对23个持有不同抗性基因的单基因系和持有Pi57(t)的水稻渗入系IL-E1454进行致病性测定。结果表明,稻瘟病菌对不同抗病基因的毒性频率存在很大差异,分离自粳稻区的稻瘟病菌菌株对持有Piz-t、Pi5、Pi9、Pi20和Pi57(t)这5个水稻品系的毒性频率分别为14.29%、5.36%、5.51%、5.36%和0;分离自籼稻区的稻瘟病菌菌株对持有Pik-h、Piz、Pita、Piz-5、Pita-2、Pi5、Pi7和Pi9这8个水稻品系的毒性频率分别为18.25%、9.13%、9.64%、7.50%、15.72%、0、13.05%和0;分离自陆稻区的稻瘟病菌菌株菌株对持有Pik-h、Pib、Pish、Pi1、Pi5、Pi9、Pi11和Pi57(t)这8个水稻品系的毒性频率分别为6.67%、3.33%、13.79%、13.33%、7.69%、6.67%、0和3.23%;交配型测定结果显示,陆稻区菌株可交配率为100.00%,...     

黑龙江省水稻种质抗瘟性及稻瘟病菌致病性分析

为明确黑龙江省水稻种质抗性及稻瘟病菌的致病性,以黑龙江省8个水稻品种、24个单基因系作为供试材料,120株稻瘟病菌株作为接种体,采用喷雾接种法测定了各供试水稻的抗瘟性及稻瘟病菌的致病性。结果表明,水稻品种对2010年和2011年菌株的抗性频率分别在31.67%~68.33%和21.67%~55.00%之间,2010年最好的抗性品种为松粳12,2011年最好的抗性品种为五优稻4和东农425;松粳12东农425组合联合抗病性最好。水稻单基因系对2010年和2011年菌株的抗性频率分别在10.00%~90.00%和5.00%~86.67%之间,抗性最好的单基因系分别为IRBLzt-T(Pi-zt)和IRBLz5-CA(Pi-z5);松粳12、东农425和龙粳22的基因聚合效果最好。2010年和2011年菌株对抗瘟基因群的致病率分别在8.33%~95.83%和25.00%~95.83%之间;无毒基因总出现频率分别为461和412次。研究表明,水稻种质抗性受菌株致病性影响较大,但高抗种质相对稳定,基因聚合方式更适宜当地品种抗性改良。     

非亲和性稻瘟病菌对水稻的诱导抗性

为研究稻瘟病菌Magnaporthe oryzae不同菌株间的相互作用,选择与单抗性基因系水稻IRBL5-M （携带抗性基因Pi5）表现为亲和性的菌株HN52与非亲和性的菌株HN119为研究对象,将其单独或混合接种到单抗性基因系水稻IRBL5-M中,并通过荧光显微镜观察接种后水稻叶鞘的发病情况及病斑面积,测定接种后水稻内相关抗性基因OsWRKY45、OsNPR1、OsPR10、OsMAPK2的表达量以及活性氧的变化。结果显示,相较于单独接种亲和性菌株,混合接种后单抗性基因系水稻IRBL5-M病斑发病面积减少;混合接种中亲和性菌株HN52菌丝侵染能力降低,侵染菌丝细胞间扩展率显著降低73.13%;同时单抗性基因系水稻IRBL5-M中OsWRKY45、OsNPR1、OsPR10和OsMAPK2抗性基因表达量显著增加,水稻叶片中活性氧含量增加,表明在菌株混合侵染过程中,非亲和性菌株可通过激发水稻的抗性反应来降低亲和性菌株对水稻的侵染程度。     

黑龙江省稻瘟病菌育性及其交配型分析

为明确黑龙江省采集自不同年份、不同地区的稻瘟病菌Magnaporthe oryzae的育性能力和交配型分布,采用2株标准菌株GUY11(MAT1-2)和KA3(MAT1-1)对2016—2017年黑龙江省西部、东部、中部3个地区经单孢分离的241株稻瘟病菌进行育性测定,并利用PCR技术对其交配型进行检测。结果表明,黑龙江省西部、东部、中部的241株稻瘟病菌中可育性菌株比例为11.62%,其中雌性菌株、雄性菌株、两性菌株分别占1.66%、4.56%和1.25%,不能判断其性别的未知菌株占4.15%。采集自不同地区、不同年份的稻瘟病菌可育性差异均较大,西部、东部、中部地区可育性菌株出现频率分别为13.25%、7.27%和12.62%;2016年采集的稻瘟病菌可育性较高,可育性菌株出现频率为25.30%。黑龙江省稻瘟病菌群体中同时存在MAT1-1和MAT1-2两种交配型,主要以交配型MAT1-1占优势,出现频率为58.92%,交配型为MAT1-2的菌株出现频率为8.30%。不同地区稻瘟病菌的交配型亦有差异,交配型为MAT1-1的菌株在黑龙江省东部地区出现频率最高,为72.73%,在中部、西部地区的出现频率次之,分别为61.17%和46.99%。表明黑龙江省水稻种植区的稻瘟病菌同时存在2种交配型菌株,其交配型存在丰富的多态性,但其可育性及交配型分布不均衡。     

稻瘟菌二肽基肽酶V基因DppV的功能分析

为明确二肽基肽酶V（dipeptidyl-peptidase V,DppV）在稻瘟菌Magnaporthe oryzae中的生物学功能,采用在线软件对稻瘟菌DppV进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR（quantitativereal-time PCR,qRT-PCR）技术分析其在稻瘟菌分生孢子不同萌发时间的表达量,通过基因敲除和功能回补、致病力测定等方法对其功能进行分析。结果表明,稻瘟菌DppV蛋白含有信号肽,定位于胞外,不含跨膜结构域,没有GPI锚定位点,为经典分泌蛋白,含DAP2结构域;其与小麦顶囊壳Gaeumannomyces tritici、早熟禾巨座壳Magnaporthiopsis poae、新烟曲霉Aspergillus novofumigatus和巴斯德伊蒙菌Emergomyces pasteurianus蛋白序列的相似度较高,分别为68.92%、68.41%、51.09%和49.96%;在稻瘟菌分生孢子萌发早期DppV基因均有表达,但当萌发时间为24 h时,其相对表达量最高,为5.61;稻瘟菌DppV基因敲除突变体菌株的菌落生长速度明显下降,产孢量（8.18×10⁴个/cm²）和4个产孢相关基因MoHox2、MoCon8、MoSec22和MoCos1的相对表达量显著降低,分生孢子萌发率（56.21%）明显下降,对SDS、NaCl、山梨醇和H₂O₂胁迫更加敏感,对水稻的致病力显著降低,水稻植株内真菌生物量明显减少,而稻瘟菌DppV基因回补菌株的表型、耐胁迫能力和致病力等则恢复到稻瘟菌野生型菌株的水平。表明DppV基因在稻瘟菌营养生长、产孢、致病力、对外界胁迫的应答及其在水稻体内的定殖等方面起着重要作用。     

辽宁省稻瘟病菌对稻瘟灵的抗性监测及其对稻瘟病的田间防治效果

为明确辽宁省水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae对稻瘟灵的抗性水平及变化动态,本研究于2017—2019年自辽宁省6个市的6个稻区采集并分离获得187株稻瘟病菌,利用菌丝生长速率法测定这187株稻瘟病菌菌株对稻瘟灵的敏感性及抗性,并采用茎叶喷雾法测定稻瘟灵对水稻稻瘟病的田间防治效果以及该药剂与其它药剂的交互抗性。结果表明：供试187株稻瘟病菌菌株对稻瘟灵的EC₅₀范围为0.94~34.96 μg/mL,左侧正态分布峰内EC₅₀平均值为5.05 μg/mL,稻瘟病菌对稻瘟灵的敏感性分布频率不符合正态分布,表明菌群中已经出现对稻瘟灵敏感性下降的亚群体。187株稻瘟病菌菌株对稻瘟灵的平均抗性倍数为3.70,抗性菌株出现频率为55.61%,平均抗性指数为0.40,抗性水平呈逐年增加趋势。2017—2019年稻瘟灵对水稻叶瘟病的防治效果分别为82.97%、78.86%和81.36%,对水稻穗颈瘟的防治效果分别为79.81%、77.68%和80.20%,说明在现有防控手段下未产生高水平抗性群体。稻瘟灵与肟菌酯、戊唑醇之间无交互抗性。与不同药剂轮换使用的前提下,稻瘟灵仍可作为主要药剂防治稻瘟病。     

黄芩苷对稻瘟病菌细胞生长发育的影响及其对稻瘟病的防效

为研制新型绿色高效稻瘟病防控药剂,分别测定黄芩苷对稻瘟病菌Magnaporthe oryzae附着胞形成、菌落生长、菌丝侵染和致病力的影响以及对稻瘟病的防效。结果显示,黄芩苷抑制稻瘟病菌附着胞形成和菌落生长的最低浓度分别为100 μmol/L和500 μmol/L,在100 μmol/L浓度下黄芩苷能抑制稻瘟病菌侵染菌丝在水稻叶鞘细胞中的扩展及叶片病斑的形成;在盆栽接种试验中,对照组的水稻苗表现为感病和中抗,所占比例分别为38%和62%,而黄芩苷处理组的水稻苗表现为抗病和中抗,其中表现为抗病的水稻苗比例超过70%;黄芩苷处理后,稻瘟病菌分生孢子细胞死亡率比对照组极显著降低。表明黄芩苷通过抑制稻瘟病菌分生孢子的细胞程序性死亡干扰了稻瘟病菌附着胞的形成,从而能有效防控稻瘟病,具有开发为新型绿色高效稻瘟病防控药剂的潜力。