犬腺病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的CAV Hexon基因序列和CPV VP2基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。经过条件优化建立了检测CAV和CPV的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以含有CAV Hexon基因和CPV VP2基因的重组质粒标准品为模板绘制标准曲线,其相关系数(R~2)均大于0.990,CAV和CPV荧光定量PCR均具有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅对CAV-I型、CAV-II型和CPV检测结果为阳性,而对犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒检测结果均为阴性,表明其特异性强。该方法的敏感性检测结果显示其检测下限为10拷贝/μL。重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。利用普通PCR方法与本实验建立的方法分别对感染CAV(10份)和CPV(27份)的犬模拟病料样品进行检测,两种方法对CAV和CPV检测的符合率分别可达100%和96.30%。本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于CAV和CPV的临床检测。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gE基因保守区的核苷酸序列设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV野毒的TaqMan实时荧光定量PCR方法。应用该方法检测猪常见病毒性病原(猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型),PRV gE基因缺失株,以及健康猪的组织,结果均为阴性,证明该方法特异性良好。该检测方法能够检到的阳性质粒模板最低浓度为254 copies/μL,最低病毒浓度为4.22 TCID_(50)/100μL,比常规PCR敏感性高10倍;重复性试验结果表明该方法重复性良好;用TaqMan实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时检测37份临床样品,其中前者检出阳性病料22份,阳性检出率为59.64%,后者检出阳性病料15份,阳性检出率为40.54%,2种方法的符合率为81.08%。综上所述,该方法的建立为PRV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

弓形虫LAMP荧光检测方法的建立与应用

为建立一种弓形虫环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法，以弓形虫高度重复性保守序列为模板，设计合成2组引物，对引物组进行比对和反应条件优化，确定特异性与灵敏度。结果表明，建立的方法在62℃50 min内对弓形虫的检测灵敏度为1 copies/μL,灵敏度高于行业标准(NY/T 573—2022),且优于市售的实时荧光定量PCR检测试剂盒，与血吸虫、猫弓首蛔虫、犬巴贝斯虫、犬新孢子虫、钩端螺旋体均无交叉反应。应用LAMP荧光方法检测已知背景信息的200份弓形虫临床样品，检出阳性样品10份，阴性样品190份，检测结果与标准方法、荧光定量PCR检测结果一致。本研究建立的LAMP方法具有快速、灵敏度高、特异性强、仪器设备适用范围广等优点，适于在兽医实验室及动物医院推广应用。     

犬细环病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL~5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。     

鹅圆环病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为54.10拷贝/μL;特异性好,与水禽常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅GoCV出现1个特异性单峰,Tm值为（84.46±0.09）℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.26%～0.55%和0.23%～0.87%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时对64份临床样品进行GoCV感染的检测,结果显示,常规PCR方法检出阳性样品15份,阳性率为23.44%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品18份,阳性率28.13%,且15份PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展GoCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。     

犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL~4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。     

犬圆环病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立了犬圆环病毒(canine circovirus, CanineCV)EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法。用PCR方法克隆CanineCV Rep基因中的高保守区，扩增的目的片段大小为217 bp,将其克隆至pMD18-T载体上，构建PCR检测阳性参考质粒，并用阳性参考质粒，进行各项反应条件优化。建立的标准曲线呈现出较高拟合性的线性回归，R²值为0.999 5;该方法检测灵敏度为3.88×10¹ copies/μL;在重复性试验中，组内和组间重复变异系数均小于2%,表明该方法具有良好的重复性；该方法对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬冠状病毒等犬常见病原的检测均无交叉反应；临床样本检测表明，所建立的EvaGreen实时荧光定量PCR对CanineCV的阳性检出率为2.82%(5/177),高于普通PCR检测的CanineCV阳性率1.13%(2/177)。本研究成功建立了一种用于快速检测CanineCV的EvaGreen qPCR方法，该方法安全且具有较好的特异性、敏感性和重复性，可作为Canine...     

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R~2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。     

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法，本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物，分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并对2种方法进行了综合比较。结果显示，TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10¹ copies/μL和1.0×10² copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性；重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品，2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明，2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。     

洛阳地区宠物犬隐孢子虫病分子流行病学调查

为了解河南省洛阳市宠物犬感染隐孢子虫情况,试验采集宠物医院、宠物养殖场和宠物店的犬只粪便样品362份,其中<3月龄犬只粪便样品93份,4～6月龄犬只粪便样品103份,6月龄～1岁犬只粪便样品71份,>1岁犬只粪便样品95份。对采集的粪便样品提取DNA,设计隐孢子虫SSU rRNA基因引物,对DNA样品进行巢氏PCR扩增。PCR扩增得到的阳性产物测序后进行同源性分析及遗传进化分析。结果表明：宠物犬隐孢子虫总感染率为4.42%,其中宠物店犬的感染率最高,为8.16%,宠物医院、宠物犬养殖场和宠物店间隐孢子虫感染率差异不显著(χ²=1.88,P>0.05);<3月龄犬的感染率为9.68%,显著高于其他年龄群(1.05%～3.88%,χ²=9.14,P<0.05);16份样品SSU rRNA序列与国内分离于动物及人体的犬隐孢子虫核苷酸相似性为97.4%～100%,其中与河南省犬源分离株(登录号EU754832)、广东省人源分离株(登录号KC734571)和犬源分离株(登录号MN696800)的核苷酸相似性达100%;16...     

新孢子虫荧光PCR检测方法的研究

根据已知的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5基因序列,设计荧光定量PCR引物和荧光探针,经反应条件的优化,建立了检测新孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法的检测灵敏度为10拷贝/反应。通过对系列稀释的重组质粒进行重复性检测,Ct值的变异系数为0.50%~1.18%。应用该方法对50份牛全血和8份流产胎儿样本进行检测,有5份全血和1份流产胎儿样本为阳性,阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率（7%）高。且具有较好的特异性和可重复性,可用来对新孢子虫病快速准确检测。     

成都市区犬猫狂犬病病毒和弓形虫感染的调查

为了解四川省成都市区家养犬、猫狂犬病病毒及弓形虫的感染情况,采用商品化狂犬病病毒和弓形虫抗原快速检测试纸卡,对2010年8～10月间来自成都市区的103份家养犬以及75份家猫的唾液和血液样品进行检测;同时采用文献报道的PCR方法对家养犬血液样品中的弓形虫核酸进行检测。结果显示,103份家养犬唾液样品狂犬病病毒抗原均为阴性,而75份家猫唾液样品中,检出阳性样品5份(阳性率6.7%),可疑样品7份;103份家养犬血液样品弓形虫抗原阳性样品33份(32.0%),可疑样品22份,75份家猫血液样品中,检出阳性样品2份(阳性率2.7%),可疑样品3份。弓形虫核酸PCR检测结果显示,96份家养犬血液样品弓形虫核酸阳性样品57份(阳性率59.4%),与弓形虫抗原阳性和可疑样品总和所占比例基本一致(53.4%)。提示应重视源于家猫的狂犬病病毒和家养犬弓形虫对人的威胁。     

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的快速检测方法,本研究以LM iap基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR快速检测LM的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有LM菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为6.5 CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的139份样品进行检测,共计检出3份LM阳性样品,与国标法(GB 478930-2010)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以牛支原体p80基因为靶基因,设计特异性引物与探针,优化反应体系,建立了牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan real-time PCR)检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性评估以及临床样本检测。结果显示,特异性试验中,牛支原体2个菌株Cq值均小于18,其余13个非牛支原体菌株Cq值均大于36;敏感性试验中,最低可检3.89拷贝/μL靶DNA,是普通PCR的10~4倍(普通PCR 3.89×10~4拷贝/μL);重复性试验中,组内、组间重复的变异系数均小于1%;44份牛的临床样品利用TaqMan real time PCR检出6份阳性(阳性率为13.64%),分离培养鉴定检出7份阳性,普通PCR检测全部阴性。本研究建立了一种敏感、特异、稳定的牛支原体TaqMan real time PCR检测方法,可用于牛支原体的快速诊断和核酸定量检测。     

鉴别犬瘟热病毒强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据Gen Bank公布的犬瘟热毒株的全基因序列并参考相关文献,选择M基因保守区域合成了1对通用引物M1/M4及鉴别犬瘟热强弱毒株的特异引物M2和M3。试验证明,该方法重复性良好;检测强弱毒株的最低检出限度在10拷贝;对新城疫病毒、水貂肠炎病毒、阿留申病毒、犬腺病毒、犬细小病毒5种病毒的特异性检测均为阴性;对175份犬瘟热疑似病料进行荧光定量RT-PCR,检出127份阳性样品,其中强毒株98份,弱毒疫苗株29份,常规RT-PCR检出112份阳性样品。结果表明,该方法的敏感性高于常规RT-PCR检测,并能有效的鉴别强弱毒株。     

猪戊型肝炎病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪戊型肝炎病毒(SHEV)的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究根据SHEV基因ORF2保守区设计引物及探针,并对PCR反应条件进行优化。结果表明,该方法扩增的相关系数可达0.999,在102拷贝/μL~109拷贝/μL内具有良好的线性关系。对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和伪狂犬病毒的RNA或DNA进行检测,结果均为阴性。该方法可以检出最低拷贝数为10拷贝/μL。重复性试验结果表明该方法的批内和批间变异系数均小于3.0%。本研究使用该荧光定量PCR检测方法对黑龙江省临床收集的131份样品(肝脏45份、粪便86份)进行检测,总阳性率为11.45%,其中肝脏阳性率为22.22%,粪便阳性率为5.81%。该方法的建立为SHEV的快速检出及绝对定量奠定了良好的基础。     

霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立霍乱弧菌(VC)的快速检测方法,以VC的hlyA基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针建立实时荧光定量PCR快速检测法,同时对该方法进行了特异性、灵敏性、稳定性和重复性试验,并对145份临床样品进行了检测。结果表明:特异性试验中15株试验菌株荧光定量PCR检测只有VC菌株为阳性,表明该检测方法特异性强;灵敏性试验表明该方法的灵敏度为25 cfu/m L;稳定性和重复性试验表明同一样品重复检测4次,Ct值的变异系数均小于2%;对145份临床样品进行检测,共计检出2份VC阳性样品,与行标法(SN/T 2425—2010)检测结果一致。说明该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

根据Gen Bank中龚地弓形虫529 bp重复序列设计引物,以弓形虫RH株基因组DNA为模板,常规PCR扩增出长度212 bp的特异性保守序列,将其克隆到p GEM-T Easy载体中构建重组质粒标准品;以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立弓形虫荧光定量PCR检测方法。将该方法用于临床病死猪的弓形虫检测。结果表明:用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异相关系数0.997,平均试验间变异系数2.30%,能检出约0.05个速殖子;检测弓形虫YZ-1株与YZ-2株均为阳性,而检测水牛梭形肉孢子虫、犬等孢球虫、柔嫩艾美耳球虫基因组DNA均为阴性;检测24头病死猪,弓形虫阳性率为70.8%,略高于常规PCR方法的检出率(66.7%),但检测的69个组织样品中,荧光定量PCR方法的检出率(50.7%)明显高于常规PCR方法的检出率(34.8%)。     

羊梅迪-维斯那病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能快速检羊梅迪-维斯那病毒(MVV)的实时荧光定量PCR,根据GenBank中MVV gag基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,经过反应体系及条件优化,以定量的10倍系列稀释的阳性质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增,建立了MVV实时荧光定量PCR。结果显示,该方法对MVV DNA最小检出量为10copies/μL,比普通PCR具有较高的检出率;组内及组间变异系数均低于2%,具有较好的重复性;该方法可以特异地检测到MVV,与其他病毒性样品无交叉反应。被检的92份临床样品中,实时荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为4.3%和3.3%。为羊MVV快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

检测鼻气管鸟疫杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

利用DNAStar对GenBank上发布的鼻气管鸟杆菌(ORT)16S rRNA基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性的引物。扩增16SRNA部分保守基因序列并将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立。反应条件反复优化后,成功建立了检测ORT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对ORT的最低检测量约为100拷贝数/μL,比普通PCR高100倍;与引起禽类呼吸系统疾病的其他病原体之间无交叉反应;批内和批间试验的变异系数均小于0.63%,充分显示该方法具有良好的重复性和稳定性。对46份临床样本进行ORT检测,该方法检测的阳性样本为38份,检出率为82.26%。在38份阳性样品中,普通PCR只检出30份阳性样品,常规细菌培养只检出23份阳性样品。结果表明:本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法比其他方法更敏感,为临床上快速准确的检测、诊断禽类ORT的感染提供了敏感可靠的检测方法。