鸭胚肝细胞培养的研究

取１５日龄左右的鸭胚肝脏，经清洗、剪碎后，加入最终浓度为０．１２５％的胰酶，３７℃消化１５～２０分钟，以含犊牛血清的１９９培养基为营养液，置含５％ＣＯ＿２培养箱内培养７２小时，可制成鸭胚肝细胞单层培养物，若向培养基中加入１０％的鸭胚尿囊液，能促进细胞的生长，接种鸭肝炎病毒后，感染细胞可在４８小时出现ＣＰＥ，９６小时形成空斑。     

一种改良的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法

剪切9日龄三黄肉鸡鸡胚肝组织,胰酶消化分离肝细胞,用改良的M199培养液进行培养。结果显示,分离的肝细胞即时存活率为93.7%±2.6%;过碘酸席夫试剂染色后,胞质中布满粉红色糖原颗粒;肝细胞活力和白蛋白分泌功能在第3天达到最高水平,这是体外研究禽类肝脏功能和代谢的最佳时机。     

大口黑鲈肝细胞原代培养方法的建立

取材大口黑鲈肝脏组织,培养其原代细胞,比较研究了组织块法和酶消化法两种培养方法及不同的培养条件,以确定其最佳培养方法和条件,同时观察了长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果表明:组织块方法不适于大口黑鲈肝细胞的培养,未见细胞从组织块中迁出。而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果。胰蛋白酶浓度0.25%,消化时间20 min,分步收集肝细胞,经台盼蓝检测和血球计数板计数,平均活力>90%,每克肝重可获得3×106个分离肝细胞。在细胞活力和数量两方面达到最佳平衡。在含20%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199/L15培养基中,于4%CO2,28℃培养箱中长期培养并传代。     

大口黑鲈肝细胞原代培养方法的建立

取材大口黑鲈肝脏组织,培养其原代细胞,比较研究了组织块法和酶消化法两种培养方法及不同的培养条件,以确定其最佳培养方法和条件,同时观察了长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果表明:组织块方法不适于大口黑鲈肝细胞的培养,未见细胞从组织块中迁出。而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果。胰蛋白酶浓度0.25%,消化时间20 min,分步收集肝细胞,经台盼蓝检测和血球计数板计数,平均活力>90%,每克肝重可获得3×106个分离肝细胞。在细胞活力和数量两方面达到最佳平衡。在含20%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199/L15培养基中,于4%CO2,28℃培养箱中长期培养并传代。     

应用鸭胚肝细胞培养鸭肿头败血症病毒XD株的研究

用DMEM培养基加小牛血清培养鸭胚肝细胞,结果显示,细胞贴壁良好,72h细胞即长满瓶底,形成致密的单层细胞。将在鸭胚尿囊腔内适应了的鸭肿头败血症病毒XD株接种鸭胚肝细胞,8h后出现以细胞界限清晰、胞核肿胀、胞内颗粒增多、细胞脱落为特征的细胞病变。将细胞毒回归鸭胚尿囊腔,成典型败血症症状。     

鲤鱼肝细胞的原代培养研究

[目的]探讨鲤鱼肝细胞原代培养的最佳条件。[方法]通过对鲤鱼的肝脏细胞进行原代培养,分析不同培养基、温度、pH、胰蛋白酶浓度、生长时间对鲤鱼肝细胞生长状况的影响,并测定肝细胞活力。[结果]鲤鱼肝细胞培养的最佳条件为:温度在25℃左右,pH7.4,胰蛋白酶浓度0.250%,消化时间40 min,培养基为M199。分离肝细胞的平均存活率>85%,每克肝平均可获得3.8×106个分离细胞,在细胞活力及数量上达到最佳平衡。[结论]该研究可为建立稳定的毒理学和药理学试验模型奠定基础。     

鸭ChREBP基因表达载体构建及其对原代肝细胞和PC3细胞脂质性状的影响

[目的]探究鸭原代肝细胞脂质含量与碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达的关联性,为深入研究ChREBP基因对畜禽脂质代谢的遗传调控机制提供参考依据.[方法]采用Ⅳ型胶原酶消化法分离孵化21 d的鸭胚原代肝细胞,以DMEM高糖培养基进行培养.利用RT-PCR扩增鸭ChREBP基因编码区(CDS)序列,构建携带His标签的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His,通过脂质体法分别转染鸭胚原代肝细胞和人前列腺癌细胞(PC3);采用His标签检测试剂盒检测ChREBP基因的表达量,以脂质指标测定试剂盒测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量,并分析鸭胚原代肝细胞和PC3细胞中ChREBP基因表达与脂质指标含量的相关性.[结果]以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞均能发出绿色荧光,表明携带His标签的ChREBP基因能在鸭原代肝细胞和PC3细胞中表达.ChREBP基因表达量与鸭原代肝细胞和PC3细胞中的TG、TC和HDL含量均呈极显著正相关(P<0.01,下同),与LDL含量呈极显著负相关.[结论]以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞后均能发出绿色荧光,说明ChREBP基因表达对鸭原代肝细胞和PC3细胞中的脂质代谢作用机理相似,可促进细胞脂质累积.     

成年鸡肝细胞的分离与原代培养

以8~10周龄的雄性黄羽鸡为对象,比较了原位两步胶原酶灌流法、改良的原位两步灌流法及原位一步灌流结合组织块消化法对成年鸡肝细胞的分离效果,同时比较了不同基础培养液对成年鸡肝细胞体外培养的影响。结果表明,采用改良的原位两步灌流法可以获得分离效果很好,均匀一致且活率达90%以上的肝细胞;以Williams’medium E为基础培养液,以1×105个/cm2密度接种,4 h后肝细胞贴壁,随后在含φ=7%新生牛血清的培养液中培养24 h后,肝上皮细胞呈现典型的多角形,核圆透亮,聚集呈岛屿状生长,48 h后增殖旺盛,96 h后基本铺满培养皿底部,出现胆小管样结构,并可维持存活13 d以上。本试验为进一步建立成年鸡肝细胞无血清培养体系,体外研究其功能奠定了基础。     

鸭α-干扰素基因疫苗肌肉注射免疫鸭抗鸭瘟强毒感染的研究

将本实验室构建的鸭α-干扰素基因疫苗(pcDNA-SDIFN-α)分别按每只50、100、200μg3个剂量肌肉注射免疫樱桃谷鸭,以PBS、空载体质粒pcDNA3.1(+)和鸭瘟弱毒疫苗为对照,免疫15d后攻击感染鸭瘟强毒,于攻毒后2h、6h、12h、24h、3d、6d、9d、14d、22d、26d、33d和40d采全血,同时取死亡鸭的各组织器官,采用实时荧光定量PCR对鸭瘟病毒在鸭外周血中的动态变化和在各组织器官中的分布及含量进行检测。结果表明:①3个剂量pcDNA-SDIFN-α和鸭瘟弱毒疫苗都对鸭产生良好保护作用,免疫鸭未发生死亡;而PBS和空载体对照组3只鸭中有1只鸭死亡,死亡鸭心、肝、脾、肾、胰和各段肠管中均检测到鸭瘟病毒DNA且其含量大于pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血病毒DNA含量;②3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量比PBS和空载体对照组低,差异显著(P<0.05),特别是在2h差异极显著(P<0.01);攻毒后24h内,3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量均低于鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭,差异显著(P<0.05);3个不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组之间外周血鸭瘟病毒DNA含量差异不显著(P>0.05),攻毒初期,200μg免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量最低,100μg次之,50μg最高。研究表明,pcDNA-SDIFN-α肌肉注射免疫鸭后能产生一定的抗鸭瘟强毒感染的作用,并在攻毒初期表现出一定的量效关系。     

鸭坦布苏病毒竞争定量PCR检测方法的建立与应用

在现行PCR检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)方法的基础上,设计制备DTMUV竞争模板并以其为定量内标物建立竞争定量PCR(QC-PCR)体系。该体系特异性强、灵敏性高,竞争模板和目标模板可在400个分子/μL的水平上共扩增。临床应用结果表明,建立的体系能够满足简单快速确定病毒含量的要求。     

检测石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒间接原位PCR方法的建立

 【目的】建立能对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒（DEV）核酸进行定位的原位PCR方法,为鸭病毒性肠炎（DVE）存档蜡块的回顾性诊断、致病机理研究等提供有效的实验手段。【方法】据DEV的UL30-UL31基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以DEV感染死亡鸭肝脏组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中DEV的间接原位PCR方法并应用于人工感染DEV不同时间的鸭肝脏、DVE发病鸭的存档蜡块和临床病料检测。【结果】间接原位PCR对DVE死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阳性,而鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、鸭多杀性巴氏杆菌病、鸭沙门氏菌病和鸭大肠杆菌病死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对人工感染DEV后2、4、6、12、24、48和72 h不同时间的鸭肝脏检测结果均为阳性,阳性细胞有肝细胞、窦皮细胞和枯否氏细胞,阳性信号多出现于坏死细胞的碎片中或细胞坏死后形成的空泡内及空泡边缘;对存档蜡块、临床病料的检测与病毒分离鉴定吻合率为100%。【结论】本研究建立的间接原位PCR方法具有直观、敏感、特异性强的优点,在显示核酸阳性信号的同时,还能判别含有靶序列的细胞类型以及组织细胞的形态结构特征与病理变化。可用于DVE的诊断、分子流行病学调查、存档蜡块的回顾性诊断和致病机理的研究。     

陕西烟草主要蚜传病毒病发生及预测预报研究

研究结果表明,陕西烟田烟草蚜传病毒病的初侵原主要来自当地的冬油菜田,冬油菜带毒量占总越冬毒量的８７．３６％,烟草蚜传病毒病的主要类群有烟草黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）、烟草蚀纹病毒（ＴＥＶ）、马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）。迁入陕西烟草的有翅桃蚜和棉蚜为ＣＭＶ、ＴＥＶ、ＰＶＹ三者的共同介体,萝卜蚜是ＣＭＶ及ＰＶＹ的介体。迁入烟田的有翅蚜有２个迁飞高峰,呈双峰曲线,第１高峰期出现在５月是旬至５月底６月初,此次迁飞