棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及低温下的表达分析

根据棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)基因已知EST序列设计引物,采用RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为GhSAMDC (GenBank登录号为JN020148)。生物信息学分析表明,GhSAMDCcDNA序列全长1 874 bp,涵盖tiny ORF (tORF)、upstream ORF (uORF)和main ORF (mORF) 3个植物SAMDC基因特征ORF。其中mORF长1 064 bp,编码含355个氨基酸残基的SAMDC酶原,预测分子量为38.25 kD,该酶原含有高度保守的酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和与SAMDC蛋白快速降解有关的PEST (TIHVTPEDGFSYAS)结构域。GhSAMDC基因组DNA序列全长2 743 bp,包含3个内含子,均位于5'' UTR,其中一个位于uORF内。聚类分析表明,GhSAMDC与葡萄中该蛋白的同源关系最近,并且与其他双子叶植物聚为一类。荧光定量PCR分析结果表明,GhSAMDC表达受低温诱导,在冷敏感品种新陆早1号中基因表达水平明显高于在耐冷品种新陆早33号中。     

小麦TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证

通过RT-PCR从小麦cDNA中扩增获得一个锌指蛋白基因TaCRF2, 该基因的cDNA长度为847 bp, 序列分析表明它编码一个含有280个氨基酸的蛋白质。在线软件预测该蛋白质的相对分子质量为30.97 kD, 等电点为7.03, 且在C-末端含有一个典型的RING-H2型锌指蛋白结构域, 在N-末端含有两个跨膜结构域。氨基酸序列比对发现, TaCRF2与水稻中的一个RING型锌指蛋白(ABF95226)的相似度为82%。亚细胞定位分析显示, 该蛋白分布在细胞核和细胞膜上。Real-time PCR表达特性分析显示, TaCRF2基因的表达受干旱、盐和ABA的强烈诱导, 低温对该基因的表达量影响不明显。初步功能验证发现过表达TaCRF2基因增强了转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐性。     

向日葵盐诱导HD-Zip类转录因子HB-12的克隆及表达分析

HB转录因子家族基因在植物生长、发育、生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。根据已知序列Unigene551_All设计引物,利用SMARTer RACE技术从向日葵中克隆了一个HD-Zip类转录因子HB-12,该基因全长cDNA序列821 bp,包括长度为573 bp的开放阅读框,编码190个氨基酸。预测该蛋白的分子量和等电点分别为22.55 kD和5.58,具有一个同源异型框结构域(homeobox domain,HD)和一个同源异型框结合类亮氨酸拉链结构域(homeobox associated leucine zipper domain,HALZ),属于向日葵HD-ZipⅠ类蛋白,基因登录号为KU315052。HB-12蛋白不存在跨膜域,亚细胞定位预测其可能位于细胞核。聚类分析发现向日葵HB-12与茄科作物马铃薯和番茄HB-12基因亲缘关系较近。利用PCR技术扩增了HB-12全长cDNA对应的g DNA序列,该序列自起始密码子ATG至终止密码子TAA长度为652 bp,由2个外显子和1个内含子组成,基因登录号为KU315053。Real-time PCR结果表明,HB-12在向日葵根、下胚轴和叶中的表达存在器官特异性,且受盐、ABA及PEG的诱导表达。HB-12基因的克隆及表达分析为向日葵抗逆分子育种和功能研究奠定了基础。     

苹果β-淀粉酶基因MdBAM3的克隆和低温响应表达分析

淀粉酶(BAM)介导的淀粉降解广泛参与植物生长发育和非生物胁迫响应等生物学过程。从前期苹果低温诱导转录组研究中分离到1个参与淀粉代谢的差异表达基因片段,克隆其cDNA全长并进行序列分析。结果表明该基因与拟南芥AtBAM3同源,命名为MdBAM3 (GenBank登录号:KX276144.1)。该基因开放阅读框长度1 641 bp,编码546个氨基酸。该蛋白含有完整的葡萄糖基水解酶结构域,保守的葡萄糖基水解酶结构域外环和内环结构,以及2个谷氨酸催化残基,该蛋白包含40个氨基酸残基的cTP (Chloroplast transport peptides),表明MdBAM3蛋白是定位于叶绿体的β-淀粉酶。利用实时荧光定量PCR技术分析模拟低温(4℃)和自然低温条件下MdBAM3的表达响应及组织表达模式,该基因受4℃模拟低温诱导快速表达;自然低温下该基因在叶芽、花芽、韧皮部中的表达均显著上调,在叶芽中表达量最高,具有组织特异性,且随植株休眠的进行呈先升后降的趋势,推测MdBAM3在苹果低温胁迫响应中具有重要功能。     

菊花CgF3’H基因克隆及表达特性分析

根据菊花花器官表达序列标签序列设计引物,采用PCR和5’-RACE技术对类黄酮3'-羟化酶(F3’H)基因进行全长cDNA克隆.克隆获得F3'H cDNA全长为1 760 bp,其开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码一条包含508个氨基酸残基的多肽,GenBank登录号为AB523844.预测该基因编码的蛋白分...     

碱茅(Puccinellia tenuiflora)Put-R40g3基因的分离及其与逆境的应答

从碱茅(Puccinellia tenuiflora)cDNA文库中分离得到Put-R40g3基因(登录号:AB465547).克隆的cDNA全长为588 bp,其编码的蛋白质共195个氨基酸,与水稻,小麦和拟南芥的R40g3蛋白的氨基酸序列有较高的同源性.对经逆境处理的碱茅幼苗根、叶中该基因的表达分析结果表明,碱茅中Put-R40g3基因的表达有被ABA、盐和干旱诱导的趋势.Put-R40g3蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合在酵母细胞表达的蛋白质定位研究结果显示了Put-R40g3蛋白存在于细胞质中.同时Put-R40g3基因在酵母中表达,酵母在盐、干旱及氧化逆境条件下提高了对逆境的适应能力.这些结果暗示了Put-R40g3基因是一个与逆境相关的基因.     

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H₂O₂胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。     

陆地棉低温响应基因GhJAZ1的克隆及表达分析

为了深入研究棉花JAZ基因在低温响应中的作用机理,利用RT-PCR方法从陆地棉中棉所36中克隆出一个低温应答基因GhJAZ1(GenBank登录号KJ562212)。全长CDS序列为810 bp,编码270个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量为29.808 ku,理论等电点为8.33,为非跨膜蛋白。该基因编码蛋白具有一个N端NT结构域、一个TIFY结构域和一个C端Jas结构域。系统进化树分析发现,该蛋白与可可树和黄麻的亲缘关系最近。荧光实时定量PCR分析发现,GhJAZ1基因在下胚轴和根中显著高表达。此外,该基因还受到脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导表达,表达量变化趋势均为先升高后降低,但在MeJA诱导下该基因的表达量变化更明显。在低温胁迫下,不同低温耐性棉花材料中该基因的表达量变化程度也不同,耐低温品种中棉所36中GhJAZ1基因的上调表达更为显著,推测该基因参与了棉花低温胁迫防御反应。亚细胞定位显示,GhJAZ1蛋白定位于细胞核中。该研究可为进一步开展GhJAZ1基因低温响应的分子机制研究奠定基础。     

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp (GenBank登录号AY970822)和1 037 bp (GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA (GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA (GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blotting分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。     

白菜型冬油菜类甜蛋白的筛选、克隆及其在低温胁迫下的表达

类甜蛋白是一种能在低温胁迫下诱导表达,增强植物抗逆性的关键蛋白质。本研究运用双向电泳结合质谱技术,筛选低温胁迫下陇油7号叶片差异蛋白点,从中分离出与抗寒密切相关的类甜蛋白。根据已发表植物类甜蛋白基因TLP的保守序列设计引物,采用RT-PCR扩增陇油7号的DNA,获得TLP基因开放阅读框,长度为732 bp,编码243个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,与甘蓝型油菜(Brassica napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达99.18%,该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的GH69-TLP-SF超家族,TLP相对分子质量和理论等电点分别为26.02 k D和9.15。TLP含有一个信号肽,为亲水性蛋白,亚细胞定位预测其是在内质网中合成的蛋白。二级结构预测表明陇油7号的TLP是由不规则卷曲和延伸链组成的不稳定蛋白。实时荧光定量和半定量分析显示,在适当阈值的低温胁迫下TLP基因表达量上调,表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。     

小麦和水稻auxin基因家族的生物信息学比较分析

根据测序获得的1条260 bp cDNA片段,通过预测发现其包含小麦植物生长素(AUXIN)基因的部分编码序列,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217的cDNA中扩增获得一条608 bp的cDNA片段,该基因序列数据库(GenBank)登录号为AY902381(基因)和(蛋白).编码202个氨基酸,预计蛋白的分子量为23.0 kDa,等电点为9.93.利用已经分离的小麦生长素(AUXIN)基因的保守序列为检索序列,对小麦和水稻中的AUXIN基因家族成员进行分析,利用这些基因编码蛋白序列构建系统发生树,查找在GenBank的EST数据库中查找这些基因的ESTs表达序列,分析了这些基因在细胞中的定位情况和蛋白结构的相似性,根据已知相似基因的功能,分析该基因有进一步深入研究的必要.     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列克隆与分析

从已构建疣粒野生稻消减cDNA文库中随机挑取阳性单克隆经测序得到ESTs, 通过生物信息学分析, 选取与泛素结合酶具有同源功能的EST以RACE技术分离克隆到1个疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列, 命名为OmE2 (Oryza meyerianaBaill. ubiquitin-conjugating enzyme, OmE2), 该序列长917 bp, 最大开放阅读框为528 bp, 编码的蛋白具有175个氨基酸, 该蛋白的分子量为19.31 kD, 理论等电点为9.32。OmE2蛋白与其他物种的泛素结合酶具有高度的一致性和相似性, 含有泛素结合酶活性位点的保守序列及半胱氨酸残基, 且具有3个跨膜结构域, 推测OmE2是一类泛素结合蛋白兼跨膜蛋白。经RT-PCR分析, OmE2基因是受白叶枯病病原菌胁迫诱导表达的, 是首次从野生稻中发现的可能参与疣粒野生稻胁迫信号传导和抗病应答反应的基因。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

甘薯IbNPR1全长cDNA序列的分离与表达特性分析

在植物系统获得性抗性(SAR)中,NPR1蛋白是水杨酸介导的基因表达中关键调控因子。本研究以青农2号为试验材料,利用同源序列法和RACE技术分离甘薯SAR 途径的主要抗病信号元件NPR1 (none expresser of PR gene)的全长cDNA序列。序列分析表明,IbNPR1基因全长2 353 bp,包含一个编码586个氨基酸残基的开放阅读框,包含有类似拟南芥NPR1蛋白中的BTB/POZ和锚蛋白重复氨基酸序列结构域。聚类分析显示IbNPR1与来源于番茄的NPR1基因关系最近。Southern杂交及半定量RT-PCR分析表明,甘薯NPR1基因属于低拷贝基因家族,表达模式为组成型表达,并且SA能提高其表达水平。由该结果推测,IbNPR1可能在甘薯抵御病原物的侵染中起重要的作用。     

甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与表达

从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明：该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%, 所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。     

谷子DnaJ蛋白基因的克隆

DnaJ蛋白是近年研究较多的同热激等胁迫反应相关的基因。本研究用0.8%NaCl胁迫下的谷子幼苗提取RNA,用反转录酶M-MLV扩增得到第一链cDNA,再以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,克隆获得了完整的谷子DnaJ蛋白基因,该基因cDNA全长1 260 bp,编码419个氨基酸,具有DnaJ蛋白分子伴侣系统的3个保守结构域。将谷子DnaJ蛋白基因构建入表达载体pGFP,获得了谷子DnaJ基因的表达载体。该基因的克隆和表达载体构建,为谷子DnaJ蛋白基因的功能分析以及谷子耐热抗旱机理研究有重要意义。     

亚洲棉腺苷酸环化酶结合蛋白基因GaCAP的克隆及序列分析

 在腺苷酸环化酶结合蛋白（CAP）的编码区两端设计引物,利用PCR方法,克隆了亚洲棉CAP基因DNA和cDNA序列。经测序及生物信息学分析发现：该基因DNA序列中存在9个内含子;cDNA序列全长1425个核苷酸,总共编码471个氨基酸残基,其序列特征包含CAP蛋白家族所特有的四个结构域,因此被命名为GaCAP。它的C末端氨基酸残基可以与Actin蛋白结合;N末端带有CAP蛋白特有的RLE残基区,可介导CAP与腺苷酸环化酶发生互作,因此,该蛋白可能参与细胞对信号的应答反应进而影响细胞骨架结构的生物过程。     

白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本研究根据已发表植物抗坏血酸过氧化物酶基因APX的同源保守序列设计引物, 采用RT-PCR扩增超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号的DNA, 获得APX基因开放阅读框, 长度为753 bp, 编码250个氨基酸残基, 推导的氨基酸序列具有APX蛋白的典型特征。生物信息学分析显示, 与已报道的大白菜的APX氨基酸序列同源性达到99%, 该酶蛋白具有高度的进化保守性, 其保守序列属于植物的POD超家族, APX相对分子质量和理论等电点依次为27.7 kD和5.58;APX基因无信号肽, 是一个亲水性蛋白, 可推测其定位于细胞质中;二级结构预测表明陇油7号的APX是由不规则卷曲和α-螺旋组成的稳定蛋白。实时荧光定量PCR和酶活性分析显示, 该基因表达和酶活性受低温胁迫诱导, 表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。