鸡毒支原体PCR检测试剂盒的研制与应用

根据基因库中鸡毒支原体 1 6SrRNA的序列研制PCR检测试剂盒 ,用于检测鸡毒支原体 (MG)。结果表明该MG PCR检测试剂盒对不同MG参考菌株和地方分离株均能特异性地扩增出 732bp条带 ,而对其他禽支原体和禽病病原体的扩增结果为阴性。该MG PCR试剂盒最低能检测出 1 0 0fg的MGDNA模板。保存期测定结果表明 ,该MG PCR试剂盒在 - 2 0℃条件下保存至 1 ,3 ,6和 9个月时 ,其敏感性无明显变化 ,仍能检测到 1 0 0fg至 1pg的MGDNA模板。保存至 1 2个月时其敏感度虽降低了 1个滴度 ,但仍能 1 0 0 %检出人工感染鸡的临床样品     

应用PCR检测鸡蛋卵黄膜中鸡毒支原体的研究

鸡毒支原体（ＭＧ）是鸡慢性呼吸道病（ＣＲＤ）的病原,可引起呼吸罗音、咳嗽、鼻漏,在火鸡常引起窦炎。其可引起蛋鸡产蛋率下降,肉鸡品质下降、废弃率增高,是养禽业中危害严重的传统病之一。尤其当其与大肠杆菌、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒等并发时,造成的经济损失更严重。ＭＧ感染可以导致种鸡受精率降低［１］和经卵垂直传播［２,３,４］。从而使孵化率降低和后代成为ＭＧ阳性鸡群,这是该病原感染率非常普遍的重要原因,同时也给该病原的控制和净化带来了困难。因此确诊蛋鸡是否正在经卵传递ＭＧ…     

鸡毒支原体PCR检测方法的建立

根据已发表的鸡毒支原体种特异性序列fMG-2设计1对引物,建立检测鸡毒支原体的PCR方法.该法对鸡毒支原体能特异性扩增726 bp的目的片段,而对其他禽病原DNA模板的扩增结果为阴性.建立的PCR方法对鸡毒支原体的最少检出量为3 Pg.用建立的PCR方法对临床采集的样品进行检测,同时对相应的样品进行细菌分离,结果临床样品PCR的阳性检出率为20.5%,细菌分离培养的阳性率为0.9%,表明PCR的敏感性高于细菌分离鉴定.     

用PCR对鸡毒支原体感染的检测

应用已建立的检测 MG和 MS的 PCR方法 ,对人工接种鸡毒支原体后 2～ 2 0 d的 SPF鸡气管棉拭样品和气管、肺、肝、脾、胸肌、腿肌等器官和组织进行了检测 ;对现场采集的样品同样作 PCR检测。结果表明 ,上述人工样品均检测到病原 ,以气管棉拭样品检出最多 ;现场样品PCR的阳性检出率为 1 0 .2 8% ,分离培养的阳性率为 2 .8% ,敏感性前者高于后者。     

鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的双重PCR诊断方法,该研究根据GenBank中登录的MG gapA基因序列和MS heat shock ATP-dependent protease基因序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测MG和MS的双重PCR诊断方法。特异性检测结果显示,该方法能够扩增出729 bp的MG和309 bp的MS特异性片段,对禽巴氏杆菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、副鸡禽杆菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对MG和MS DNA的最低检出量均为5×10^-2 ng/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG、MS混合感染和单独感染。该研究建立的鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测MG和MS提供了技术支持。     

鸡毒支原体PCR检测方法的建立

目前临床上常见的支原体主要为鸡毒支原体（MG）和鸡滑液囊支原体（MS）。由于MG和MS经常发生混合感染,给临床诊断和治疗带来极大的困难。为了快速诊断MG,特别是致病性鸡毒支原体,本研究针对MG的pvpA基因设计特异性引物,通过优化反应条件,进行灵敏性试验、特异性试验和重复性试验,建立快速高效检测MG的PCR方法。结果表明,该检测技术具有较好的灵敏性、特异性强且CV<3%,具有很好的符合性。     

应用多重套式PCR检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体

根据已发表的鸡毒和鸡滑液支原体血凝素基因序列pMGA和vlhA各设计两对引物,建立鉴别诊断两种支原体的多重套式PCR方法,对其进行温度条件、Ⅱ步模板浓度优化及特异性、敏感性实验。该方法在两步PCR后能特异性地扩增出MG(408 bp)和MS(688 bp)两个目的片段。应用于临床样品检测,与支原体分离、SPA检测比较结果PCR灵敏度高于病原分离。     

鸡毒支原体

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是一种重要的禽呼吸道病原,被认为是鸡慢性呼吸道病(CRD)的首要原因;由其它微生物引起的并发症,称之为有并发的慢性呼吸道病,是当前鸡场中最常见到的疾病.由此引起的鸡或火鸡的气囊炎或窦炎在屠宰时会造成严重的损失.胴体的降级、废弃,饲料转换效     

鸡毒支原体PCR试剂盒对人工感染SPF鸡的检测

鸡毒支原体(MG)是鸡及其他禽类呼吸道疾病的主要病原体，感染鸡群常出现呼吸罗音、咳嗽、流鼻液等。本病在世界各国广泛存在，在鸡群中的感染率很高。我们在广西不同地区鸡场调查中发现，鸡群MG平均感染率达56．9％。感染本病的鸡群由于产蛋下降、生产性能低下和肉鸡胴体品质下降等，给养     

应用PCR-RFLP分析鉴定鸡毒支原体

本试验合成１对引物,对鸡毒支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ,ＭＧ）、滑液支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｙｎｏｖｉａｅ,ＭＳ）１６ＳｒＲＮＡ和２３ＳｒＲＮＡ基因的间隔区序列进行ＰＣＲ扩增,然后分别用ＲｓａⅠ、ＤｒａⅠ对上述扩增产物限制性酶,所获得的片段进行琼脂糖凝胶电泳。     

鸡毒支原体烯醇化酶的可溶性表达及检测

烯醇化酶参与支原体糖酵解、细胞黏附及免疫调节等多种生命活动,对其开展功能研究有助于了解鸡毒支原体黏附及感染机制。本研究通过重叠PCR克隆获得鸡毒支原体烯醇化酶,经原核表达获得可溶性融合蛋白rMGEno,将纯化产物免疫BALB/c小鼠后制备获得特异性多抗。通过Western blot和ELISA检测发现,烯醇化酶在鸡毒支原体不同强弱毒株中高度保守,表达产量高,在鸡毒支原体参试各毒株的细胞膜中均有分布。这一表达产物的成功制备为深入研究鸡毒支原体烯醇化酶的生物学功能奠定了基础。     

间接法Dot－ELISA检测鸡败血支原体（MG）抗原的研究

本文首次建立了检测鸡败血支原体（ＭＧ）抗原的间接法Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ。ＭＧ抗原的最低检出量为７．８１×１０￣４ＣＦＵ／ｍｌＭＧ人工及自然感染样本的抗原检测结果与ＭＧ分离的符合率分别为８４．６％和９２．９％。间接法Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测抗原经济、快速、操作简便，有较好的敏感性、特异性和重复性，能检出ＭＧ人工及自然感染病鸡的带菌情况，适合于大规模抗原样本的检测，可以用作疫病早期诊断的依据和进行流行病学调查。     

应用PCR检测单核细胞增多症李氏菌的研究

以二对位于单核细胞增多症李氏菌β－溶血素基因内的２６－ｂｐ寡核苷酸为引物，用ＰＣＲ对单核细胞增多症李氏菌进行了检测，结果所有株单核细胞增多症李氏菌均扩增出１８６－ｂＰ的特异条带，其它种李氏菌和细菌均呈阴性反应。本方法可测出模拟肉样中少至９２个细菌，模拟奶样中少至１８个细菌，其特异性和敏感性不受其它污染杂菌ＤＮＡ的影响。对市售猪肉和牛奶的检测结果表明，ＰＣＲ法优于传统的分离培养法，具有快速、简便和敏     

鸡毒支原体抗体识别抗原的基因克隆和序列分析

抗体筛选阳性克隆,用EcoRI酶切回收3．6kb外源片段,测序。序列用大肠杆菌密码进行读框分析,至少有6个开放放阅读框,而在MG可能分为3个开放阅读框,同源性分析,发现序列的某些碱基主要与肺炎支原体、生殖支原体、山羊支原体和莱氏无胆甾原体的某些地方同源性高、没有同其他细胞或病毒有同源性的地方,说明克隆的基因完全是一个新的基因片段。     

抗菌药物联合应用对霉形体的药效学研究

本研究采用试管肉汤稀释法和棋盘法测定了１７种抗菌药物单独或几种药联合对鸡败血霉形体Ｓ＿６株（ＭＧＳ＿６）的最低抑菌和最低杀菌浓度．结果表明，ＭＧＳ＿６对北里霉素、四环素、红霉素、氟哌酸等高度敏感；四环素类与ＴＭＰ联合呈现协同作用。对实验性感染ＭＧＳ＿６的病鸡进行联合用药治疗试验，初步筛选出几个有良好治疗作用的联合用药配方。本研究是对联合应用抗菌药物治疗实验性鸡败血霉形体病进行的初步探讨，对防治本病具有一定的理论与实践意义。     

鸡毒支原体F弱毒疫苗株细胞免疫特性研究

为了解鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）F弱毒疫苗株的细胞免疫特性,分别以活菌浓度为109（A组）、106（B组）ccu/mL的MG F株及生理盐水（C组）点眼接种SPF鸡,采用流式细胞技术及T淋巴细胞增殖试验对免疫前后淋巴细胞亚类Th/T、Tc/T、Th/Tc及刺激指数（SI）的动态变化规律进行研究。结果显示免疫后A、B组的Th/T、Tc/T、SI明显升高,其中Th/T于d5、d7,Tc/T、SI于d7、d14,A组显著高于B组（P〈0.05）。研究结果表明,免疫MG F株可较好的提高鸡的细胞免疫,且MG F株活菌浓度与接种鸡外周血Th/T、Tc/T、SI呈正相关。     

应用套入式聚合酶链反应(Nested-PCR)检测蓝舌病病毒的研究

本实验建立了一种Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ方法。应用方法检测５株标准株蓝舌病病毒（Ｔ４、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１６、Ｔ２０）和５株国内蓝舌病病毒分离株（ＣＦ４、ＡＦ６、Ｚ１、Ｈ１、Ｇ１４）,检测结果均为阳性,而检测相关环状病毒（ＥＨＤ２、ＥＨＤ６、Ｉｂｒａｋｉ）,检测结果均生。研究证明,此方法可检测到３．５ｆｇ的ＢＴＶ－ＲＮＡ,灵敏度较高。该方法成功区分了蓝病病毒和相关环状病毒,比血清学方法更加优势,在临床     

鸡毒支原体株间结构蛋白及其抗原性变异的比较研究

本研究以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ技术,应用鸡毒支原体国外强毒株Ｓ６、标准株ＰＧ３１,疫苗株Ｆ,北京分离 ＢＧ４４Ｔ、ＮＢ７２特异性多克隆抗血清对以上五株及疫苗株Ｖ、北京分离株Ｃ的结构及其抗原性进行了比较结果表明ＭＧ结构蛋白及其抗原性存在着株间的多样性和一定相似性,其中以Ｆ与Ｓ６、ＢＧ４４Ｔ与ＰＧ３１、ＮＢ７２与Ｃ更为接近,可能具有同源性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示出了ＭＧ株间结构蛋白微     

奶牛温氏支原体16SrRNA基因的PCR扩增、克隆及分析

目的对奶牛温氏支原体16SrRNA基因进行PCR扩增及克隆分析。方法从自然感染体的广西奶牛无菌采集血液,分离温氏支原体并提取病原基因组,用血营养菌的16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆到PGEM-Teasy载体后进行溺,I序和分析,并与Genebank上搜索的温氏支原体相应序列进行比较,建立系统发育树。结果PCR扩增得到长约1．5kb的扩增片段,测序结果显示该片段全长为1453bp,同源性分析表明该序列与Neimark公布的温氏支原体（前称温氏附红细胞体）（AF016546）的16SrRNA基因序列同源性达到97．4％,与系统发育进化树表明本株温氏支原体同本地株的关系较近,而与国外株的新缘关系较远。国内公布的广西株同源性为99．8％。结论结果表明证实该病原为温氏支原体,从分子生物学水平证实了温氏支原体在广西的存在。由于本试验分离得到的牛温氏支原体与国外发表的牛温氏支原体核苷酸序列相差2．6％,因此两者的基因型存在一定的差异,这对该病的分子流行病学分析具有一定的意义。