传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆、序列分析及原核表达鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。根据GenBank已登录的IB-DV VP2基因序列,设计合成一对VP2基因特异性引物,应用RT-PCR技术从陕西省某鸡场分离的IBDV毒株中克隆VP2基因并进行序列分析。再将VP2基因亚克隆于原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2,经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE检测。成功克隆IBDVYL毒株VP2全基因序列,核苷酸和氨基酸序列分析表明,YL株为IBDV超强毒株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,在宿主菌BL21中成功表达约为53 ku的VP2蛋白。IBDV VP2基因克隆表达成功,为IBDV的分子生物学特性研究提供资料,其表达产物为进一步制备抗IBDV单克隆抗体奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒BJ-10株VP2基因的克隆及原核表达

【目的】克隆鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ-10株VP2基因,构建其原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行高效表达。【方法】根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV BJ-10株VP2基因;将目的基因插入pMD18-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET-32α中,转化入JM109,经IPTG诱导表达,对产物进行SDS-PAGE电泳分析,确定IPTG的最佳诱导表达时间和浓度。【结果】克隆到了全长1 356bp的IBDV BJ-10株VP2基因;PCR、酶切鉴定分析表明,成功构建了重组质粒pET-32α-VP2;SDS-PAGE电泳分析表明,在宿主菌JM109中成功表达了约为60ku的VP2蛋白;IPTG诱导表达时间以4.5h为宜,诱导最佳浓度为0.8mmol/L。【结论】成功克隆了IBDV BJ-10株VP2基因,并在大肠埃希菌中表达了VP2蛋白。     

法氏囊炎病毒VP2基因高变区片段的克隆与鉴定

[目的]研究法氏囊病毒VP2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点。[方法]以接种传染性法氏囊病毒(IBDV)的鸡胚尿囊液为模板,根据Genbank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的全序列设计引物,通过RT-PCR扩增获得VP2高变区部分片段,将其克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)BL21,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个504bp的扩增片段,序列分析结果表明它与GenBank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的核苷酸序列同源性达99.8%,其氨基酸序列的同源性为99.4%,说明各毒株间高变区基因序列保守性很高。[结论]法氏囊炎病毒毒株在两个大小亲水区内的氨基酸都非常保守。     

火鸡传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆和序列比较

参考GenBank发表的传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IB-DVVP2基因的引物。以广西玉林发病火鸡群分离的IBDV野毒YL株为材料,以其基因组为模板利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于PUC119质粒上,得到重组PUC119质粒。并对VP2基因全序列测定、分析和聚类表明,YL株与欧洲超强毒株非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株，HZ96)VP2基因的质粒PBS为模板，根据其序列设计引物进行PCR扩增，得到1．5kb左右长的VP2基因产物；用Kpn Ⅰ和SalⅠ酶切纯化的PCR产物；将纯化的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301水稻胚乳特异性启动子GTl下游，并经PCR、酶切和测序鉴定．植物重组表达栽体经三亲交配已导入根癌农杆菌中．     

脑心肌炎病毒VP1基因的克隆与原核表达

【目的】为获得重组脑心肌炎病毒VP1蛋白。【方法】利用RT-PCR方法对脑心肌炎病毒的VP1基因进行特异性扩增,并在pEASY-Blunt Zero载体中进行克隆。测序正确后,用Nde I和Hind III对重组质粒进行双酶切,将目的片段连接入原核表达载体pET-30a,提取质粒pET-30a-VP1,将质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达和纯化。【结果】重组的结构蛋白VP1以包涵体的形式存在,纯化后获得的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在31.5kD处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-30a-VP1。【结论】以原核系统成功表达脑心肌炎病毒VP1蛋白,进一步为犬的脑心肌炎病毒的血清学检测奠定基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒 PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5 kb左右长的VP2基因产物;用KpnⅠ和 SalⅠ酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在 T4 DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301 水稻胚乳特异性启动子GT1下游, 并经PCR、酶切和测序鉴定.植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中.     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达

通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4⁰.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

IBDV超强毒株和弱毒株VP2基因同义密码子使用偏爱性研究

应用RT-PCR方法扩增并克隆了分离自河南省的30株IBDV超强毒和9株弱毒株VP2基因cDNA序列,研究IBDV超强毒和弱毒株的VP2高变区基因不同位点同义密码子的使用情况。结果表明,超强毒株和弱毒株除特定位点的特征性氨基酸不同外,在同义密码子的使用上也有明显的偏爱性。这预示着同义密码子的使用与VP2基因表达及其表达产物的空间结构有关,进而可能影响到IBDV的毒力。     

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

构建含有传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)VP2/4/3和鸡白细胞介素2(Chicken Interleukin 2,ChIL-2)融合基因的真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,并在Vero细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension),分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-IL-2、IL-2-VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,在脂质体介导下,分别转染Vero细胞.RT-PCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot检测证实重组质粒在Vero细胞中正确表达了插入的外源基因编码的融合蛋白,且表达的融合蛋白具有免疫反应性.重组真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3的成功构建及其在Vero细胞中的有效表达,为进一步探讨ChIL-2作为分子免疫佐剂对IBDV DNA疫苗的特异性免疫增强作用奠定了基础.     

稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白突变体细胞系的建立

根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)HZ2株VP2基因序列设计1对引物,将该基因成功克隆到真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed2-N1-VP2(简称PVP2);以PVP2作为过渡载体,运用PCR定点突变技术,对第279位点和第284位点的氨基酸残基分别或同时进行突变,共构建P279、P284和PDA 3株突变体;在此基础上构建能稳定表达HZ2株IBDV及其突变体VP2蛋白的Vero细胞系,间接免疫荧光试验检测表明,Vero细胞系中IBDV VP2蛋白已成功表达.这为进一步深入研究IBDV毒力及抗原变异致病机制奠定了基础;此外,利用定点突变技术改造VP2蛋白,建立不同毒力的突变体,在探求高效、廉价的IBDV DNA疫苗上也有广阔的应用前景和重要意义.     

抗IBDV VP2单克隆抗体制备及其免疫学鉴定

采用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒弱毒Gt株,并与Tj强毒株共同免疫BALB/c小鼠.利用淋巴细胞杂交瘤技术,取其脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行融合, 经过3次筛选克隆, 获得8株具有分泌抗IBDV抗体的杂交瘤细胞系,并对8株单抗进行了分子生物学及免疫学方面的鉴定.间接ELISA显示获得的8株单抗只与IBDV有特异性的反应,Western-blotting表明,部分单抗能够特异地与Sf9细胞表达的VP2蛋白反应;中和试验表明8株单抗均具有中和活性,而且有3株中和效价在26以上.研究推测,8株单抗中有2株针对的表位为构象依赖性,其余6株单抗所针对的为线性中和性表位.     

乌鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法,对分离于当地典型发病乌鸡群的IBDV(WJ株)进行了VP2基因的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,WJ株与标准血清 型STC株的核苷酸和氨基酸的同源性只有91.39%和92.74%,而与超强毒株UK661和从当地鸡群中分离的超强毒株HN01株的核苷酸和氨基酸的同源性则较高,其中,与其核苷酸同源性分别为95.43%和95.87%,与其氨基酸同源性均为96.77%。且该毒株的VP2基因序列完全具备超强毒株的主要特征。由此说明,分离于当地发病乌鸡群的IBDV为超强毒株,并和当地流行的鸡IBD超强毒株有较高的同源性,但也有明显的差异。     

鸡传染性法氏囊病毒河南Xin-1株VP2基因的克隆与鉴定

应用反转录(RT-PCR)技术从河南传染性法式囊发病鸡中总RNA克隆出1461bp的VP2基因,并将其克隆于pGEM-T载体,筛选并构建了pT-VP2克隆载体。序列分析表明,该VP2基因及推导氨基酸序列与日本和欧洲超强毒株序列有较高的同源性,特征性氨基酸变异相似,进化分析也表明Xin-1毒株与欧洲超强毒株UK661和日本超强毒株OKYM位于同一进化分支,提示Xin-1株病毒可能为超强毒株。     

家蚕表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的免疫原性初步研究(英文)

在家蚕培养细胞及幼蚕中表达传染性法氏囊病病毒（IBDV）主要宿主保护性抗原VP2蛋白的基础上,初步研究了该表达产物的免疫原性。Western免疫印迹和ELISA均检测到春蚕和秋蚕中的VP2蛋白活性。含VP2的春蚕蚕血制成的注射疫苗皮下注射18日龄非免疫鸡,两周后二免;含VP2的秋蚕蚕血冻干制成口服疫苗,隔天喂服18日龄非免疫鸡。于首免后第10,13,21,28,37日分别采血,第37日攻毒。病毒血清中和试验显示注射组及口服组的中和抗体滴度最高可达1∶4211.3和1∶3118.9,攻毒结果显示它们对IBDV中国标准强毒株BC6/85的攻击保护率为100%和80%。以上研究表明家蚕表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,从而为开发实用化低成本的疫苗打下了扎实基础。IBDV亚单位疫苗的口服免疫有效是一个重要发现。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

传染性囊病病毒CJ801 VP2基因cDNA的序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ从传染性囊病病毒ＣＪ８０１的第１４代囊毒中扩增编码ＶＰ２蛋白的ｃＤＮＡ基因片断，长度为１５００ｂｐ，并对该片断进行了ＤＮＡ序列分析。结果表明，ＣＪ８０１与ＩＢＤＶ标准Ⅰ型毒株５２／７０、ＳＴＣ和Ｃｕｌ的同源性最高，分别为９７４％、９７６％和９６９％，与变异株Ａ、Ｅ、ＧＬＳ的同源性稍低，分别为９６５％、９６３％和９６７％。而与Ⅱ型毒株的同源性只有８１％左右。从遗传进化树上看，ＣＪ８０１处于标准Ⅰ型毒株和变异株之间。根据ｃＤＮＡ序列推导出蛋白质序列，比较蛋白质序列发现，ＣＪ８０１与Ⅰ型ＩＢＤＶ毒株的同源性均在９６％以上，其中与５２／７０的同源性最高，为９８２％。ＣＪ８０１ＶＰ２高可变区的七肽区（Ｓ－Ｗ－Ｓ－Ａ－Ｓ－Ｇ－Ｓ）未发生变化。以上结果说明ＣＪ８０１为ＩＢＤＶⅠ型强毒株。另外，ＣＪ８０１和所有ＩＢＤＶ强毒株在ＶＰ２的２５３、２７９和２８４位上的氨基酸均相同，分别为Ｑ、Ｄ和Ａ；而ＣＪ８０１的细胞适应株ＣＪ８０１ＢＫＦ和所有弱毒株一样，其相应位置的氨基酸分别为Ｈ、Ｎ和Ｔ。这３个氨基酸可能和ＩＢＤＶ的毒力有关。