联合固氮遗传工程菌的田间释放与风险评价

应用遗传工程技术分别将含有ｎｉｆＡ＾ｃＤＮＡ片段的质粒及含有Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ的广泛宿主自杀性质粒ｐＳＺ３６转入了三个联合固氮菌，即粪产碱菌，阴沟肠杆菌及催娩克氏菌中；把Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ－ｎｔｒＣ转入了粪产碱菌野生型菌株Ａ１５０１。这些转化结合子在高铵下表现出固氮活性，并能集聚在水稻根表，而野生型菌在相同条件下远离水稻根表。这些菌株的田间释放实验在严格控制条件下进行，应用＾１５Ｎ稀释技术测定其固     

nifH—lacZ融合基因在粪产碱菌中及联合固氮条件下的表达调节

将巴西固氮螺菌ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ转入粪产碱菌Ａ１５０１中，β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性测定结果表明，该转录型融合基因ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ在Ａ１５０１中的表达为诱导型的，在固氮条件下高水平表达，在高铵好氧下低水平表达，在无铵好氧下部分表达。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析证明在粪产碱菌中存在ｎｉｆＡ、ｒｐｏＮ和ｎｔｒＣ基因的同源序列，表明粪产碱菌ｎｉｆＨＤＫ的转录启始可能为ＮｉｆＡ和α＾５４依赖型的。携     

固氮粪产碱菌ntrC基因的表达及固氮调节功能研究

采用双亲结合方法，将粪产碱菌Ａ１１５０ｌｎｔｒＣ和ｎｔｒＣ－ｌａｃＺ融合基因转入Ａ１５０１中，获得携带双拷贝ｎｔｒＣ的结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ１）和ｎｔｒＣ－ｌａｃＺ融合基因的结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ２）。在微好氧条件下，当铵为６ｍｍｏｌ时结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ１）仍保持３４．８％的固氮活性，表明在粪产碱菌中ｎｔｒＣ具有固氮正调节功能。在不同铵、氧、ｐＨ和盐浓度等条件下测定结合子Ａ１５０１     

异源nifL在粪产碱菌的表达及功能研究

本实验采用两亲结合方法，将棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）的ｎｉｆＬ－ｌａｃＺ融合基因转入固氮粪产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｎｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ａ１５０１中获得了携带异源ｎｉＬ－ｌａｃＺ融合基因的结合子Ａ１５Ｌ１。对野生型和结合子的固氮活性，β－半乳糖苷酶活性及根表定殖能力的测定结果表明：（１）异源ｎｉｆＬ在粪产碱菌中的表达受Ｏ２和ＮＨ＾＋４的抑制，好氧条件下基因表达     

水稻根际固氮粪产碱菌的研究（综述）

粪产碱菌分离自我国南方水稻田中，根据系统发育分类法属变形细菌中β亚类。粪产碱菌不仅能附着于水稻根表，部分细菌还能进入稻根细胞内，有较高的固氮能力，在高铵下它仍能合成固氮酶，并具有明显的ＰＧＰＲ作用。本文系统地论述了粪产碱菌的生物学特性及其联合固氮研究的进展。     

固氮粪产碱菌nifH基因的亚克隆及其启动子的核苷酸序列分析

采用＾３２Ｐ标记的巴西固氮螺菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＨ ＤＮＡ探针，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ａ１５０１总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ同源的ＤＮＡ序列。在不同ＮＨ４＾＋浓度下测定ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ融合基因在粪产碱菌结合子中的β－半乳糖苷酶活性，结果证明该融合基因的表达受     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）表面蛋白变构作用的研究

采用电子自旋共振技术（ＥＳＲ），以马来酰亚胺自旋标记粪产碱菌野生型（Ａ１５０１）、胞外多糖突变株（ｅｘｏ＾－和ｅｘｏ＾＋＋）及工程菌（ｎｉｆ某Ａ和ｎｔｒＣ－ｎｉｆＡ重组子），监测由粪产碱菌表面多肽及些膜蛋白构象变化引起的ＥＳＲ波谱的变化。结果表明，粪产碱菌野生型菌株细胞表面特性显著不同于胞外多糖突变株及工程菌，根系粘质及ＮＨ４＾＋都能引起粪产碱菌表面蛋白的构象变化，标记后菌体ＥＳＲ参数τｃ的变化与     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)的反硝化及固氮作用

粪产碱菌生长在NH_4~+和NO_3~-两种氮源的介质中时,优先利用NH_4~+,在好气条件下,NH_4~+的存在抑制了粪产碱菌对NO_3~-的同化作用。在厌氧条件下,粪产碱菌能以乳酸为碳源,NH_4~+为唯一氮源进行反硝化作用,NO_3~-作为最终电子受体,接受无氧呼吸链传递的末端电子,经NO_2~-等氮氧化物最终还原为N_2。在好气和厌气条件下,低浓度的NO_2~-对粪产碱菌生长有一定抑制作用,但NH_4~-的存在并不抑制细菌对NO_2~-的利用。粪产碱菌在厌氧条件下还具有需硝酸盐的固氮酶活性。当氧存在或以NO_2~-代替NO_3~-时,固氮活性均受抑制,硝酸盐或亚硝酸盐浓度愈高,抑制愈强。反硝化作用产生的N_2能为微好氧条件下生长的粪产碱菌所重新固定。     

粪产碱菌耐铵工程菌与水稻联合共生固氮作用

粪产碱菌（ Ａａｅｃａｌｉｓｆａｅｃａｌｉｓ） 在ＬＷ 培养基下能产生植物激素ＩＡＡ。盆栽结果表明,接种Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ 显著提高了水稻的生长,接种Ａ１５０１ 和Ａ１５１３ 的水稻稻谷产量分别比未接种提高了８５％ 和１０３ ％ ,用１５ Ｎ 同位素稀释法估测水稻地上部总氮中来源联合固氮的百分率达９００ ％ 和１１５ ％ ,其结果与水稻地上部（ 茎叶及稻谷） 总氮量的增加幅度（８６ ％ 和１１６ ％ ）基本一致。研究还表明Ａ１５１３ 耐铵工程菌的产ＩＡＡ作用以及对水稻的生长和产量、联合固氮作用均优于原始菌株Ａ１５０１ 。     

固氮粪产碱菌基因文库的构建及ntrC的克隆

采用广泛寄主范围的粘粒载体ｐＬＡ２９１７构建粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ的基因文库。以巴西固氮螺科菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｎｔｒＣ ＤＮＡ为探针，经菌落杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选获得含ｎｔｒＣ－ｌｉｋｅ基因的阳性克隆ｐＬＡＦ５８，建立了含ｎｔｒＣ同源序列的９．５ｋｂ ＳａｃＩ片段的物理图谱，采用巴西固氮螺菌ｎｔｒＢ ＤＮＡ探针杂交证明粪产碱菌ｎｔｒ     

固氮粪产碱菌中nif,ntr和gln基因鉴定及nifA克隆

本工作采用＾３２Ｐ标记的与固氮（ｎｉｆ）和一般氮代谢（ｎｔｒ和ｇｌｎ）系统有关的基因探讨，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤＫ、ｎｔｒＡ，ｎｔｒＣ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ同源的ＤＮＡ序列。以Ａｚｏｓｐｉｒｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＡ ＤＮＡ为探针，经三轮杂交筛选。     

水稻施用耐氨固氮菌的效应研究

定位试验表明：施用耐氨固氮菌能促进水稻根系对氮素的吸收，显著增加水稻产量，耐氨固氮菌具有固氮能力，但按现行的施用量则固氮水平不足３０ｋｇ／ｈｍ＾２，在施氮水平较高的情况下，施用耐氨固氮菌能增加土壤有机质，全氮和碱解氮含量。     

蔬菜作物施用耐氨固氮菌的增产效果

研究在小区试验条件下，施用耐氨固氮型的催娩克氏菌和阴沟肠杆菌混合菌剂对蔬菜生长 产量的影响。结果表明：施用耐氨固氮菌可促进蔬菜生长，提高产量并改善品质，供试蔬菜的平均增产率达２０％，增产效果明显。     

受固氮活性制约的蓝藻固氮去铵阻抑及其与生理条件的关系

在不同气体环境中培养的蓝藻Ａｎａｂａｅｎａ７１２０固氮活性各异，Ａｒ＋ＣＯ２中最大，空气中次之，Ａｒ中最小。固氮活性高者去铵阻抑速率大，反之则小。它们对各种生理条件的反应不一样，固氮活性高者，其去铵阻抑速率受氧和氮的抑制小。在氢和氧加合条件下，三种活性的蓝藻去铵阻抑均加快，但活性低者慢而小些。光强减弱或加光合抑制剂时，固氮活性低者去铵阻抑速率显著小于活性高者，而添加外源的蔗糖或丙酮酸时，也是固氮活     

马铃薯内生固氮菌的分离及其促生特性研究

内生固氮菌是一类重要的植物促生菌,占据着植物组织内有利于营养供应和微环境适宜的生态位,能更好的发挥促生功能,促生机制包括固氮、解磷、产植物生长素、产ACC脱氨酶、产铁载体及拮抗病害等。本文从连作3年马铃薯根筛选获得8株内生固氮菌,其中短芽孢杆菌属(Brevibacterium)3株,芽孢杆菌属(Bacillus)3株和泛菌属(Pantoea)2株。促生特性研究发现:菌株Brevibacterium sp.GWR4具有较高固氮酶活性[16.206nmol C2H4/(mg蛋白质·h)],与圆褐固氮菌的固氮酶活性具有极显著性差异(P0.01);菌株Pantoea spp.GWR2、GWR3具有极高的产IAA能力,分别为186.07、162.21μg/m L,GWR2兼具产ACC脱氨酶活性[3.74μmol/(mg蛋白质·h)],GWR3兼具溶解无机磷的能力;菌株Brevibacterium sp.GWR5可以拮抗尖孢镰刀菌MLSOF(Fusarium xysporum)和茄病镰刀菌MLS-QB(Fusarium solani),兼具溶解有机磷和产IAA能力;Bacillus spp.GWR7、GWR8兼具固氮和产IAA能力。盆栽试验显示,分别接种Pantoea sp.GWR3,Brevibacterium spp.GWR4、GWR5和Bacillus spp.GWR7、GWR8后小白菜鲜重显著高于未接菌对照处理。可见,这5株菌兼具多种促生特性且对小白菜具有较好的促生效果,有望进一步研究开发成为微生物肥料生产菌种。     

钼对甘蔗体内固氮菌的固氮酶活性的影响

以巴西固氮甘蔗品种B1和B8为材料,在温室桶栽砂培条件下,对甘蔗施以含不同钼水平的营养液,以了解钼对甘蔗体内固氮菌的固氮酶活性的效应。结果表明,在含氮条件下,较低浓度的钼处理能提高甘蔗根内固氮菌的固氮酶活性,高浓度钼处理则能提高B1茎、叶片和B8茎中固氮菌的固氮酶活性;在无氮条件下,钼处理提高了B1叶片和茎中固氮菌的固氮酶活性,而B1根及B8根、茎、叶中固氮菌的固氮酶活性有所降低。此外,甘蔗根、茎、叶中固氮菌的固氮酶活性之间关系较为密切,根中固氮菌的固氮酶活性与叶片和茎中的都呈负相关。上述结果说明:巴西甘蔗在本地也具有一定的固氮能力;在不缺氮条件下,钼处理较利于调节甘蔗体内固氮菌的固氮酶活性,促进其固氮;而在缺氮条件下,钼处理不利于调节甘蔗体内固氮菌的固氮酶活性,抑制其固氮作用。     

固氮粪产碱菌nifH∷gusA融合基因的构建及在根际联合体系中…

采用ＰＣＲ技术，获得含粪产碱菌ｎｉｆＨ基因启动子的０．６ｋｂＨｉｎｄ－Ⅲ－ＢａｍＨＩ的扩增片段，核苷酸序列分析结果表明，该ＰＣＲ产物的序列与已报道的模板ｎｉｆＨ启动子序列完全一致。通过两轮基因连接、转化和筛选，获得ｎｉｆＨ启动子与ｇｕｓＡ正向连接的融合基因表达载体ｐＴＧＹ７。经三亲结合将ｐＴＧＹ７导入粪产碱菌中，证明该融合基因能在结合子中正常表达。采用融合基因表达的组织化学定位方法，研究粪产碱菌在     

两种不同土壤条件下可培养甘蔗内生固氮菌的多样性

为明确不同土壤条件对甘蔗内生固氮菌多样性的影响,对分别种植在红壤土和水稻土的4个甘蔗品种的内生固氮菌进行分离和鉴定,并利用数学生态学方法分析不同来源内生固氮菌的多样性。结果表明,从红壤土的甘蔗组织中分离筛选获得23个内生固氮菌株,它们在基于16S r DNA序列分析结果上属于9个不同的菌属;而从水稻土的甘蔗组织中获得59个内生固氮菌株,分类上属于19个不同的菌属。群落生态学分析结果显示,来源于水稻土的甘蔗内生固氮菌的群落丰富度指数(dma)、多样性指数(H')以及均匀度指数(Jsw)均明显高于红壤土,表明水稻土条件下的甘蔗内生固氮菌群落结构相对复杂、稳定和均匀;而相同土壤条件下4个甘蔗品种间的内生固氮菌丰富度指数和多样性指数差异并不明显。本研究结果反映了土壤生态条件是影响甘蔗内生固氮菌多样性的重要因子。     

固氮菌肥料生产菌株的酶活性测定

将从非豆科作物根际土壤中分离，筛选的１１个具有固氮能力的菌株，用气相色谱法测定它们在自生培养条件下乙炔还原活性，经检测均具有较强的固氮酶活性。培养液的全氮分析，也具有相吻合的结果。这些菌株经几个的大田试验，增产效果显著，可望作为固氮菌肥料的生产菌株而用于多种作物。     

一株具有固氮功能的烟草根际微生物的鉴定及其初步效应

应用16S rDNA序列分析构建系统发育树,结合生理指标、生化反应,对分离自烤烟根际的固氮菌菌株N05进行了分类鉴定,并通过小区试验探讨其对烤烟生产的效应。结果表明,自生固氮菌N05属于产碱菌属（Alcaligenes）,粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）。将固氮菌N05制成菌肥,烤烟移栽时施入（30 kg/hm2）同时施用80% 的氮肥（B+80% N）,与全量施用氮肥（FN）相比,B+80% N烤烟根际固氮菌的数量平均提高3.6倍,放线菌的数量显著降低;圆顶期烤烟根际土壤中除Mg 元素的有效性略有降低外,P、K、Ca、Cu、Zn、Fe和 Mn 等元素的有效性均有不同程度的提高,提高幅度在 2.51%～ 46.08%。烤烟杀青样中 N 的平均含量也高于FN。在减施氮肥的情况下,应用固氮菌肥可提高烤烟根际固氮菌数量和矿质元素的有效性。