植物病原细菌hrp基因研究现状和展望

从ｈｒｐ（过敏性反应和致病性）基因簇，ＤＮＡ序列的同源性，基因表达调控与ａｖｒ基因（无毒基因）的关系和基因的功能等几个方面较为详细地综述了植物病原细菌ｈｒｐ基因的研究现状，并分析了ｈｒｐ基因研究的未来趋势。     

瓜类细菌性果斑病菌过敏性反应和致病性(hrp)基因簇部分基因的克隆及功能分析

过敏性反应和致病性(hrp)基因存在于革兰氏阴性植物病原细菌中,决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应(hypersensitive response,HR)。本研究从果斑菌(Acidovorax avenaesub sp.citrulli)的hrp基因簇中克隆了hpaA、hrcT、hrcC和hrpG基因,通过同源重组的方法,分别构建了其突变体。电镜观察发现,hpaA和hrpG基因突变体的鞭毛缺失且细胞形态发生显著变化,而hrcT和hrcC基因突变体的鞭毛和细胞形态未发生明显变化。在烟草(Nicotiana tabacam)和哈密瓜(Hami cantaloupe)叶片上的测定结果显示,hpaA、hrcT和hrcC的突变体均失去在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜叶片上的致病性;hrpG在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜上的致病性则显著减弱;进一步的生长曲线测定结果表明,hpaA、hrcT、hrcC和hrpG的突变体的定殖能力均显著下降。相应地,功能互补后突变体基本恢复至野生表型。证明瓜类细菌性果斑病菌hrp基因作为Ⅲ型分泌系统关键组份影响病原细菌对寄主植物的致病性和对非寄主及抗病植物的过敏性...     

土传病原细菌的生存与致病权衡

土传病原细菌严重威胁土壤-植物系统健康和农业可持续发展。在接触和入侵寄主植物根系之前,病原细菌会经受土壤pH、含氧量、营养物质种类和数量等非生物因素骤变以及其他土壤微生物的竞争、寄生和捕食等生物胁迫。病原细菌的生物膜形成、代谢、运动、毒力、DNA修复以及对噬菌体、抗生素或环境压力的抵抗能力等特性对其在土壤环境中生存和侵染寄主非常重要。为适应复杂且多变的土壤生物和非生物环境,病原细菌必须动态权衡其生存和致病力之间的关系,维持其生存、传播、增殖和侵染致病间的平衡,以最大化其在土壤环境中的适应性。系统理解土传病原细菌应对胁迫和侵染寄主植物的过程及权衡机制是建立精准、高效生态防控手段的关键。为此,以土传病原细菌为代表,总结了土传病原细菌生存与致病的权衡规律和典型现象及土壤中的生物和非生物影响因素,阐述了土传病原细菌入侵植物根际过程中的生存与致病权衡机制,并提出一些与土传病原细菌生存与致病权衡相关的科学问题,呼吁建立基于生存-致病权衡理论的土传病害生态防控策略,为绿色农业可持续发展提供理论参考。     

土传病原细菌的生存与致病权衡

土传病原细菌严重威胁土壤-植物系统健康和农业可持续发展。在接触和入侵寄主植物根系之前,病原细菌会经受土壤pH、含氧量、营养物质种类和数量等非生物因素骤变以及其他土壤微生物的竞争、寄生和捕食等生物胁迫。病原细菌的生物膜形成、代谢、运动、毒力、DNA修复以及对噬菌体、抗生素或环境压力的抵抗能力等特性对其在土壤环境中生存和侵染寄主非常重要。为适应复杂且多变的土壤生物和非生物环境,病原细菌必须动态权衡其生存和致病力之间的关系,维持其生存、传播、增殖和侵染致病间的平衡,以最大化其在土壤环境中的适应性。系统理解土传病原细菌应对胁迫和侵染寄主植物的过程及权衡机制是建立精准、高效生态防控手段的关键。为此,以土传病原细菌为代表,总结了土传病原细菌生存与致病的权衡规律和典型现象及土壤中的生物和非生物影响因素,阐述了土传病原细菌入侵植物根际过程中的生存与致病权衡机制,并提出一些与土传病原细菌生存与致病权衡相关的科学问题,呼吁建立基于生存-致病权衡理论的土传病害生态防控策略,为绿色农业可持续发展提供理论参考。     

植物抗真菌和细菌病害的基因工程

随着植物分子生物学的迅猛发展和对寄主－病原菌相互作用的深入了解，植物抗病菌基因工程策略不断出现。本文从以下两方面评述了目前植物抗真菌和细菌病害的基因工程策略研究进展：（１）调控寄主－病原相互识别和信号传递系统表达介导的抗性；（２）调控防卫反应基因和外源抗菌基因表达介导的抗性。     

添加卫星RNA对黄瓜花叶病毒寄主反应及其在系统寄主中含量的影响

为了解卫星RNA(satRNA)对辅助病毒在系统寄主中的直接影响,将1株黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)的卫星RNA(satRNA)sat-Yi与本身不携带卫星RNA的CMV分离物CNa在体外进行假重组,获得了人工构建的假重组毒株CMV-NY。通过寄主反应测定、双链RNA分析和全序列分析,显示satYi与CMV-CNa基因组RNA能够稳定共存,经过反复转接也没有发现卫星RNA的序列突变。通过测定CMV-CNa和NY这2个病毒株的寄主反应,发现satRNA-Yi的存在明显延迟了CNa在所有供试寄主中的发病时间,而且明显减弱了其在多数供试寄主上的症状表现,其中在葫芦科植物上表现出减轻症状的效果最明显;用一种新建的核酸玻片杂交方法,定量测定寄主植物中CMV基因组CP基因及卫星RNA的相对含量变化,结果显示:26℃条件下,在接种5、10、15、20、25和30d的心叶烟中,2个毒株的CP基因含量都呈下降趋势,在相应的时间内,NY-CP基因在同一寄主中的含量均低于CNa-CP基因的含量;接种10d,NY与CNa的寄主适应性没有显著差异,二者基因组CP基因在6种寄主植物中的相对含量均为番茄>假酸浆>心叶烟>西葫芦>南瓜>曼陀罗。由此得出以下结论:sat-Yi降低了CMV CP基因在寄主中的含量,且随着接种时间的增加,卫星RNA的影响作用越明显;sat-Yi不改变CMV基因组RNA的寄主适应性,但是通过降低CP基因含量改变其症状特征。     

水稻白叶枯病菌基因XOO2193的突变体构建及其毒力和胞外多糖分析

水稻白叶枯病菌是一种引起水稻白叶枯病的植物病原细菌,水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一。本研究采用携带同源序列的自杀质粒pK18MobGⅡ整合的办法构建了水稻白叶枯病菌中国菌株13751编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因XOO2193的非极性突变体GNM2193。对突变体的表型分析发现其毒力在杂交水稻品种特优63上显著减弱,突变体在非寄主植物蓖麻上不能引起过敏反应。此外,突变体胞外多糖的产量是野生型的43.4%。用一段含有XOO2193基因的DNA片段对GNM2193进行功能互补,互补菌株在水稻上的毒力、引起过敏反应的能力和胞外多糖产量恢复到野生型水平。说明XOO2193基因与病菌的毒力和胞外多糖的产生有关。     

水稻细条斑病菌的化学诱变及hrp基因突变体的功能互补研究

硫酸二乙酯（ＤＥＳ）化学诱变水稻细条斑病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）ＲＳ１０５获得６株ｈｒｐ突变体,其在寄主水妥上失去致病性和在非寄主烟草上失去激发过敏反应（ｈｒｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ,ＨＲ）的能力。将水稻白叶枯病菌（Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）日本系统Ⅲ号小种（ＪＯＸⅢ）基因文库和ＲＳ１０５基因文库互补ＲＳ１０５ｈｒｐ突变体Ｍ５５,     

梨火疫病菌分子检测新靶标——EAsdiA基因的克隆与应用

SdiA属于与群体效应相关的luxR家族基因，目前已证实存在于Escherichia coli和Salmonella typhimurium基因组中。本研究从梨火疫病菌中克隆到了一个sdiA的同源基因，命名为EAsdiA，该基因与Es. coli和S. typhimurium的sdiA基因在氨基酸水平上分别有45.42%和43.33%的同源性，与其他细菌的luxR同源基因的同源性更低。根据梨火疫病菌EAsdiA和其它病原细菌的luxR基因的序列比对设计了一对特异引物F-EAluxR和R-EAluxR，该引物能够特异地检测梨火疫病菌，检测灵敏度为 10个菌体，在含有梨组织浸出液的情况下可检测到102个菌体。本研究是首次从梨火疫病菌中克隆SdiA基因并应用于该病菌分子检测的报道。     

EAsdiA基因的克隆和作为新靶标对梨火疫病菌的检测

基因sdiA属于与群体效应相关的LuxR家族,目前已证实存在于Escherichia coli和Salmonella typhimurium基因组中。本研究从梨火疫病菌(Erwinia amylovora)中克隆到了一个sdiA的同源基因,命名为EAsdiA(GenBank登录号:AY864839),该基因与E.coli和S.typhimurium的sdiA基因在氨基酸水平上分别有45.42%和43.33%的同源性,与其它细菌的luxR同源基因的同源性更低。根据梨火疫病菌EAsdiA和其它病原细菌的luxR基因的序列比对设计了1对特异引物F-EAluxR和R-EAluxR,能够特异地检测梨火疫病菌,检测灵敏度为10个菌体,在含有梨组织浸出液中可检测到102个菌体。本研究首次从梨火疫病菌中克隆sdiA基因并作为新靶标应用于该病菌分子检测。     

一个可用于鉴定野油菜黄单胞菌正向调控hrpX基因的报告质粒的构建

过敏性反应与致病性基因(hrp)所编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是植物病原细菌的决定性致病因子。在黄单胞菌属中,HrpG是目前已知的hrp基因表达的最高层面的调节蛋白,至今尚未鉴定到野油菜黄单胞菌调控hrpG表达的基因。本研究利用hrpX启动子和蔗糖敏感型sacB基因构建了hrpX表达报告质粒。实验结果表明该报告质粒可用于筛选鉴定正向调控野油菜黄单胞菌hrpX表达的基因。该报告质粒的构建,为研究hrp基因表达调控机制,揭示植物病原细菌的致病机制提供了有效的材料。     

旱生植物梭梭actin基因片段的克隆及表达模式分析

本研究根据其它植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以3周龄梭梭整株总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析结果表明：该片段长约598 bp,编码198个氨基酸;该序列与GenBank中现有的植物Actin比对发现,同源性均高达84%,同时,翻译得到的氨基酸序列与其它植物的氨基酸序列同源性高达99%。表达实验分析表明在不同胁迫条件下该基因在梭梭不同组织中表达量恒定,可作为内参基因。梭梭actin基因片段的克隆可为研究重要抗逆功能基因在梭梭中的表达和调控机制奠定基础。     

根瘤菌中的nodD基因及其与弗兰克氏菌（Frankia）中的类nodD基因的功能互补

根瘤菌可在几种豆科植物上成瘤,结瘤基因（ｎｏｄ基因）赋予这些细菌以寄主专一性的方式诱导瘤的形成。目前,已被鉴定的三类主要结瘤基因是：＂公共＂结瘤基因,如ｎｏｄＡＢＣ,这类基因是结瘤不可缺少的,并具有高度的结构和功能上的保守性;另一类是寄主专一性基因,这类基因具有种属或菌株的专一性,它们决定了细菌的寄主范围;最后一类是结瘤基因Ｄ（ｎｏｄＤ）,这类基因编码一类调节蛋白,并和植物分泌的酚类化合物一道起动其他结瘤操纵子的转录。一些根瘤菌种属只有一个拷贝的ｎｏｄＤ基因,而另一些则可拥有三个拷贝之多。苜蓿根瘤菌（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）中存在三个拷贝的ｎｏｄＤ基因,其中的任何一个发生突变都以依赖于寄主的方式影响结瘤效果。在慢生型大豆根瘤菌（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）中,ｎｏｄＤ１突变菌株还可在大豆或其他豆科植物寄主上结瘤,只是稍往后推迟而已,ｎｏｄＤ２基因对ｎｏｄＹＡＢＣＳＵＩＪ操纵子诱导的影响却很小,两个ｎｏｄＤ拷贝突变后尚表现出结瘤活性。在只有一个ｎｏｄＤ基因拷贝的根瘤菌种属中,如豌豆根瘤菌（Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）和茎瘤固氮菌（Ａ．ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）中,ｎｏｄＤ突变后会导致菌株丧失结瘤能力。一般说来,不     

根癌农杆菌Ⅵ型分泌系统关键组分ClpⅤ型ATPase基因表达及活性位点分析

细菌Ⅵ型分泌系统（type Ⅵ secretion system,T6SS）是近年发现的一种分布广泛且与细菌致病性密切相关的新型分泌系统,ClpⅤ型ATPase是不同细菌T6SS中均含有的关键保守组分,据推测可能为底物蛋白的分泌提供动力,但对其生化功能尚未进行深入鉴定。在本研究中,我们克隆了根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）C58中的ClpⅤ型ATPase基因atu4344并在大肠杆菌中表达,酶学检测证实了其ATPase活性,定点突变分析发现K232/608和E299/675突变体均丧失ATPase活性,表明Walker A模体和Walker B模体与其活性密切相关。这是首次对植物病原细菌T6SS中的ClpⅤ型ATPase进行生化鉴定和突变分析研究。     

根系分泌物抑制连作障碍线虫病的根际调控机制及其应用

作物长期连作极易出现连作障碍(再生病害),本文围绕因传统耕作模式和种植习惯而诱发的新疆棉花、黑龙江大豆、河南花生、山东设施蔬菜、两广香蕉等连作障碍问题,对全国连作现象进行系统分析,发现全国连作现象普遍。按照耕地面积将连作障碍划分为五个等级,其中华北三省和东北的黑龙江省连作障碍等级最高,且各省连作现象均以大田经济作物为主。以香蕉、大豆(大田经济作物)、黄瓜(设施园艺作物)和三七(中草药)为代表,比对最低产量和正常产量在连作年份的变化,表明连作障碍发生规律成抛物线式,防控连作障碍需找到问题关键时期。单一根系分泌物介导的微生物多样性降低、病原菌富集,植物寄生线虫危害和土壤弱化是导致连作障碍的主要原因,其中线虫对植物的侵染危害作为土传病害是防治连作障碍中最难解决的问题之一,尤其是在设施蔬菜上。线虫在长期进化过程中形成了具有识别、寻找和侵染寄主的生物学功能,而不同植物根系分泌物对线虫发育和对宿主的识别侵染能力有不同的调控作用。针对根系分泌物–线虫互作为诱因的线虫病害,深入探讨易感作物和抗性/非寄主植物根系分泌物对线虫发育和对植物侵染的生物学机制,提出根际调控措施。在J2时期利用抗性/非寄主植物根系分泌物,调控根结线虫Mi-16D10、Mi-flp-18等基因和孢囊线虫的Hg-rbp-2等基因的表达控制线虫的发育、侵染和迁移,通过生物源功能物质定向防控线虫侵染作物。这些结果加深了我们对生物活性物质调控植物寄生线虫机制的认识。未来,以筛选和鉴定抗性或非寄主作物特异根系分泌物对线虫侵染的调控为依据,配置生物功能型肥料,利用植物源活性物质替代传统农药控制线虫病害的根际调控措施,定向调控植物根际生物学过程将成为国内外研究热点。此文将为未来深入系统地研究根系分泌物–线虫的相互作用及克服连作障碍提供理论基础,进而促进土壤健康和作物优质高产高效,对实现绿色农业和可持续发展具有重要的理论和实践指导意义。     

两种基因型蕹菜镉积累与其根际微生物的关系研究

通过自制根箱试验,研究了两种基因型蕹菜茎叶中的镉含量与植物根际微生物(细菌、真菌、放线菌)的关系。结果表明:两个蕹菜品种茎叶中的镉含量存在基因性差异;同一品种根际微生物数量显著大于非根际土壤(p0.01);两种基因型蕹菜品种间微生物数量存在极显著差异(p0.01);植物茎叶镉含量与根际微生物数量存在显著的负相关关系,且相关程度为真菌细菌放线菌。表4,参14。     

丛枝菌根与植物寄生性线虫相互作用及抗性机制

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)能够与大多数陆地植物互惠共生,促进植物对养分的吸收,提高植物对各种生物和非生物胁迫的抗逆性,对植物健康生长有重要的作用。在土壤中丛枝菌根真菌与植物寄生性线虫共同依靠寄主植物根系完成生命循环,但二者对寄主植物作用完全相反,引起研究者广泛兴趣,成为菌根研究的热点和焦点之一。本文分析了丛植菌根真菌与植物寄生线虫的相互作用,并探讨了菌根提高植物对线虫抗性的可能机制:菌根真菌改善植物的生长和营养状况、改变植物根系形态结构、影响根系分泌物和根际微生物区系、诱导寄主植物产生防御反应等,旨在深入挖掘丛枝菌根真菌的生物学功能,进一步发挥其在农业生产中的应用潜力。     

含有增强型绿色荧光蛋白报告子的载体系统的构建

将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体pLAFR6上,构建报告质粒pLZY。将野油菜黄单胞菌的已知效应物基因xopXccN启动子和分泌转运信号区序列克隆到pLZY,重组质粒导入野油菜黄单胞菌,阳性克隆细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光。阳性克隆接种萝卜叶片,在共聚焦激光扫描显微镜下检测观察到在植物细胞内发荧光,而含有pLZY的野油菜黄单胞菌对照菌株菌体和植物细胞内都检测不到绿色荧光,证明报告质粒pLZY工作正常。该报告质粒为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌Ⅲ型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料。     

昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良

摘要：随着大量施用化学农药所造成的环境污染等问题日益突出，真菌杀虫剂的研究和开发受到了广泛的关注。由于存在击倒昆虫时间较长、对环境条件要求高等缺点，昆虫病原真菌的广泛应用受到限制。因此，有必要弄清昆虫病原真菌致病寄主过程的遗传学和分子生物学机理，找出控制毒力的主效基因。在此基础上，利用基因工程和细胞工程等技术提高菌株毒力，创造出更适合市场需要的真菌杀虫剂。文章重点介绍了近年来有关昆虫病原真菌致病机理的研究进展，包括侵染寄主过程中附着胞的形成、降解昆虫体壁的分子机理和昆虫病原真菌的毒素等。同时，还介绍了昆虫病原真菌的遗传转化方法和基因工程改良的一些新进展。     

黄河三角洲贝壳堤放线菌多样性及抑菌活性

研究旨在揭示黄河三角洲贝壳堤放线菌多样性,以便从中寻找新的具有生物防治功能的微生物资源。采用3种分离培养基,利用稀释平板涂布法对贝壳堤土壤样品进行分离;通过形态特征、生理生化实验及16S rDNA基因测序对放线菌进行了分类鉴定。结果表明分离到的174株放线菌分属于10个科,13个属,其中链霉菌属(42%)和拟诺卡氏菌(11%)为优势菌属。16S rDNA基因分析表明,61%的菌株与已知菌的相似性都在99%以下,其中菌株BK-17的16S rDNA序列与同源性最近的菌株相似率仅为95.2%。以2株细菌和5株植物病原真菌作为指示菌,进行了抑菌活性测定,有94株至少对1种指示菌有抑菌作用,有8株对7种指示菌都有很强的拮抗作用。以上研究结果表明黄河三角洲贝壳堤土壤中存在丰富的放线菌资源,存在很多潜在的新菌种和活性菌株,有进一步研究和开发的价值。