固氮粪产碱菌ntrC基因的表达及固氮调节功能研究

采用双亲结合方法，将粪产碱菌Ａ１１５０ｌｎｔｒＣ和ｎｔｒＣ－ｌａｃＺ融合基因转入Ａ１５０１中，获得携带双拷贝ｎｔｒＣ的结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ１）和ｎｔｒＣ－ｌａｃＺ融合基因的结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ２）。在微好氧条件下，当铵为６ｍｍｏｌ时结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ１）仍保持３４．８％的固氮活性，表明在粪产碱菌中ｎｔｒＣ具有固氮正调节功能。在不同铵、氧、ｐＨ和盐浓度等条件下测定结合子Ａ１５０１     

固氮粪产碱菌nifH基因的亚克隆及其启动子的核苷酸序列分析

采用＾３２Ｐ标记的巴西固氮螺菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＨ ＤＮＡ探针，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ａ１５０１总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ同源的ＤＮＡ序列。在不同ＮＨ４＾＋浓度下测定ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ融合基因在粪产碱菌结合子中的β－半乳糖苷酶活性，结果证明该融合基因的表达受     

异源nifL在粪产碱菌的表达及功能研究

本实验采用两亲结合方法，将棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）的ｎｉｆＬ－ｌａｃＺ融合基因转入固氮粪产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｎｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ａ１５０１中获得了携带异源ｎｉＬ－ｌａｃＺ融合基因的结合子Ａ１５Ｌ１。对野生型和结合子的固氮活性，β－半乳糖苷酶活性及根表定殖能力的测定结果表明：（１）异源ｎｉｆＬ在粪产碱菌中的表达受Ｏ２和ＮＨ＾＋４的抑制，好氧条件下基因表达     

联合固氮遗传工程菌的田间释放与风险评价

应用遗传工程技术分别将含有ｎｉｆＡ＾ｃＤＮＡ片段的质粒及含有Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ的广泛宿主自杀性质粒ｐＳＺ３６转入了三个联合固氮菌，即粪产碱菌，阴沟肠杆菌及催娩克氏菌中；把Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ－ｎｔｒＣ转入了粪产碱菌野生型菌株Ａ１５０１。这些转化结合子在高铵下表现出固氮活性，并能集聚在水稻根表，而野生型菌在相同条件下远离水稻根表。这些菌株的田间释放实验在严格控制条件下进行，应用＾１５Ｎ稀释技术测定其固     

固氮粪产碱菌中nif,ntr和gln基因鉴定及nifA克隆

本工作采用＾３２Ｐ标记的与固氮（ｎｉｆ）和一般氮代谢（ｎｔｒ和ｇｌｎ）系统有关的基因探讨，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤＫ、ｎｔｒＡ，ｎｔｒＣ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ同源的ＤＮＡ序列。以Ａｚｏｓｐｉｒｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＡ ＤＮＡ为探针，经三轮杂交筛选。     

固氮粪产碱菌nifH∷gusA融合基因的构建及在根际联合体系中…

采用ＰＣＲ技术，获得含粪产碱菌ｎｉｆＨ基因启动子的０．６ｋｂＨｉｎｄ－Ⅲ－ＢａｍＨＩ的扩增片段，核苷酸序列分析结果表明，该ＰＣＲ产物的序列与已报道的模板ｎｉｆＨ启动子序列完全一致。通过两轮基因连接、转化和筛选，获得ｎｉｆＨ启动子与ｇｕｓＡ正向连接的融合基因表达载体ｐＴＧＹ７。经三亲结合将ｐＴＧＹ７导入粪产碱菌中，证明该融合基因能在结合子中正常表达。采用融合基因表达的组织化学定位方法，研究粪产碱菌在     

粪产碱菌耐铵工程菌与水稻联合共生固氮作用

粪产碱菌（ Ａａｅｃａｌｉｓｆａｅｃａｌｉｓ） 在ＬＷ 培养基下能产生植物激素ＩＡＡ。盆栽结果表明,接种Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ 显著提高了水稻的生长,接种Ａ１５０１ 和Ａ１５１３ 的水稻稻谷产量分别比未接种提高了８５％ 和１０３ ％ ,用１５ Ｎ 同位素稀释法估测水稻地上部总氮中来源联合固氮的百分率达９００ ％ 和１１５ ％ ,其结果与水稻地上部（ 茎叶及稻谷） 总氮量的增加幅度（８６ ％ 和１１６ ％ ）基本一致。研究还表明Ａ１５１３ 耐铵工程菌的产ＩＡＡ作用以及对水稻的生长和产量、联合固氮作用均优于原始菌株Ａ１５０１ 。     

固氮粪产碱菌基因文库的构建及ntrC的克隆

采用广泛寄主范围的粘粒载体ｐＬＡ２９１７构建粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ的基因文库。以巴西固氮螺科菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｎｔｒＣ ＤＮＡ为探针，经菌落杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选获得含ｎｔｒＣ－ｌｉｋｅ基因的阳性克隆ｐＬＡＦ５８，建立了含ｎｔｒＣ同源序列的９．５ｋｂ ＳａｃＩ片段的物理图谱，采用巴西固氮螺菌ｎｔｒＢ ＤＮＡ探针杂交证明粪产碱菌ｎｔｒ     

重组耐铵固氮菌株的田间长期定点释放试验

以广泛分布于我国南方水稻田的固氮粪产碱菌为起始菌株，通过遗传重组手段构造了耐铵菌株Ａ１５１３和Ａ１５２３，田间累计释放面积已达万公顷以上。接种重组耐铵固氮菌株的增产幅度及田间固氮率（Ｎｄｆａ％）均高于野生型。长期定点释放试验证明：在不施肥条件下，长期施用固氮菌剂不影响土壤肥力，对土著微生物群落的生态平衡也不构成威胁。重组子所携带的抗性基因在自然条件下不能扩散，并在无选择压力下逐渐丢失。根据粪产碱菌     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）exoC基因的克隆及其特性

应用Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｓｐ７的ｅｘｏＣ基因为探针，发现Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ Ａ１５０１具有与Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｅｘｏＣ基因同源的基因。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｅｘｏＣ基因能恢复Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＥＰＳ缺陷型（ＥＰＳ＾－）突变，表明粪产碱菌ＥＰＳ的产量为ｅｘｏＣ基因产物所调控。本工作已获得类似Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７的ｅｘｏＣ－ｌｉｋｅ基因的克隆     

水稻根际固氮粪产碱菌的研究（综述）

粪产碱菌分离自我国南方水稻田中，根据系统发育分类法属变形细菌中β亚类。粪产碱菌不仅能附着于水稻根表，部分细菌还能进入稻根细胞内，有较高的固氮能力，在高铵下它仍能合成固氮酶，并具有明显的ＰＧＰＲ作用。本文系统地论述了粪产碱菌的生物学特性及其联合固氮研究的进展。     

甘蓝黑腐病菌rPf基因簇对胞外蛋白酶Ⅰ基因表达的调控

甘蓝黑腐病黄单胞菌（ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＰｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）产生的胞外蛋白酶Ⅰ在致病的早期阶段起重要作用，该酶以及其它胞外酶和胞外多糖的合成受一致病因子调控基因簇（ｒＰｆ基因簇）的正向调控。本研究利用带有β－半乳糖苷酶报道基因（ｌａｃＺ）的转座子Ｔｎ５－Ｂ２０诱变蛋白酶Ⅰ基因克隆，获得了ｌａｃＺ在蛋白酶Ⅰ基因启动子控制下表达的Ｔｎ５－Ｂ２０插入突变质粒。通过将这种突变质粒导入野生型和各ｒｐｆ基因突变体菌株后，测定ｌａｃＺ基因在细胞生长周期中的表达水平，不仅进一步证实了这些ｒｐｆ基因对蛋白酶Ⅰ基因的正向调控作用，而且明确了它们的调控水平．发现ｒｐｆＡ、ｒｐｆＣ、ｒｐｆＥ、ｒｐｆＧ或ｒｐｆＨ突变后，蛋白酶Ⅰ基因的转录会降低９０％左右，而ｒｐｆＢ突变后，蛋白酶Ⅰ基因的转录只降低４８％。     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)的反硝化及固氮作用

粪产碱菌生长在NH_4~+和NO_3~-两种氮源的介质中时,优先利用NH_4~+,在好气条件下,NH_4~+的存在抑制了粪产碱菌对NO_3~-的同化作用。在厌氧条件下,粪产碱菌能以乳酸为碳源,NH_4~+为唯一氮源进行反硝化作用,NO_3~-作为最终电子受体,接受无氧呼吸链传递的末端电子,经NO_2~-等氮氧化物最终还原为N_2。在好气和厌气条件下,低浓度的NO_2~-对粪产碱菌生长有一定抑制作用,但NH_4~-的存在并不抑制细菌对NO_2~-的利用。粪产碱菌在厌氧条件下还具有需硝酸盐的固氮酶活性。当氧存在或以NO_2~-代替NO_3~-时,固氮活性均受抑制,硝酸盐或亚硝酸盐浓度愈高,抑制愈强。反硝化作用产生的N_2能为微好氧条件下生长的粪产碱菌所重新固定。     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）表面蛋白变构作用的研究

采用电子自旋共振技术（ＥＳＲ），以马来酰亚胺自旋标记粪产碱菌野生型（Ａ１５０１）、胞外多糖突变株（ｅｘｏ＾－和ｅｘｏ＾＋＋）及工程菌（ｎｉｆ某Ａ和ｎｔｒＣ－ｎｉｆＡ重组子），监测由粪产碱菌表面多肽及些膜蛋白构象变化引起的ＥＳＲ波谱的变化。结果表明，粪产碱菌野生型菌株细胞表面特性显著不同于胞外多糖突变株及工程菌，根系粘质及ＮＨ４＾＋都能引起粪产碱菌表面蛋白的构象变化，标记后菌体ＥＳＲ参数τｃ的变化与     

苏云金芽胞杆菌cry1A基因启动子上激区不同位点突变对BtI—la …

利用苏云金芽胞杆菌ｃｒｙ１Ａ启动子上游区的不同突变体,观测对ＢｔＩ－ｌａｃＺ融合基因表达的影响。结果发现,突变上游弯曲区,导致ＢｔＩ－ｌａｃＺ在菌标８０－２１中的酶活性大幅度下降,均比未突变的上游区降低２－２．５倍。而在菌株ＨＤ１３３－５中却出现相反的结果,即上游弯曲区的突变导致ＢｔＩ－ｌａｃＺ的表达比未突变体增高。如果同时突变弯曲区和反射重复区,则ＢｔＩ－ｌａｃＺ在菌 表达增强或下降的幅度大大减     

受固氮活性制约的蓝藻固氮去铵阻抑及其与生理条件的关系

在不同气体环境中培养的蓝藻Ａｎａｂａｅｎａ７１２０固氮活性各异，Ａｒ＋ＣＯ２中最大，空气中次之，Ａｒ中最小。固氮活性高者去铵阻抑速率大，反之则小。它们对各种生理条件的反应不一样，固氮活性高者，其去铵阻抑速率受氧和氮的抑制小。在氢和氧加合条件下，三种活性的蓝藻去铵阻抑均加快，但活性低者慢而小些。光强减弱或加光合抑制剂时，固氮活性低者去铵阻抑速率显著小于活性高者，而添加外源的蔗糖或丙酮酸时，也是固氮活     

固氮根瘤菌的生理特性及对非豆科生物的拌种效果

固氮根瘤菌（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ ５７１）不但能在毛萼田菁（Ｓｅｓｂａｎｉａ ｒｏｓｔｒａｔａ）上结出根瘤和茎瘤进行共生固氮，有屏氧功能可进行自生固氮，该菌生长过程分泌一定的植物中刺激作物生长。将该功晟菌种剂拌种小麦、水稻、玉米、马铃薯进行小区对比试验和大田示范。三年的结果表明，供试作物的经济性状得以不同程度的改善，经对照获得明显的增产增收效果。     

混合固氮菌剂-水稻联合体系的固氮特性

应用＾１５Ｎ示踪技术研究敢南京土壤条件下混合固氮菌剂－水稻联合体系的固氮特性。结果表明，紫香糯稻接种混合菌剂后，稻株利用的固氮量为１．０３ｋｇ／６６６．７ｍ＾２，固氮率６．７％；拔节期－齐穗期是固氮高峰期，日平均固氮量达２４．３１ｍｇ／ｍ＾２·ｄ，这阶段固氮量占整个生育期固氮量的４０．９％；拔节期－成熟期的固氮量占整个生育期固氮量的７０％以上；节肥能力为每６６６．７ｍ＾２ １１３．３ｋｇ硫铵；稻谷     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）胞外多糖突变株的筛选及特性

应用Ｔｎ５转座子对粪产碱菌野生型菌株Ａ１５０１进行诱变处理，用荧光增白剂及ＴＴＣ为标记筛选，分别获得胞外多糖缺陷型和丰富型突变株。激光共聚焦观察证实，ＥＰＳ突变株确实具有与野生型不同的表面特性，贴根试验表明，突变株贴根菌数均少于野生型，胞外多糖生成过多或过少均影响菌体与根表的有效结合。     

固氮细菌氮调节系统（ntr和gln）的基因组成及调控机制（综述）

固氮基因的表达受氮调节系统ｍｉｆＡＬ操纵子的调节控制。ｎｔｒＣ在氮调节和固氮基因表达过程中起关键作用。本文阐述了氮调节系统的基因组成，作用机制和研究进展，并讨论了在联合固氮菌中氮调节基因的作用及工程固氮菌构建的可能途径。