利用PCR法从文库中快速克隆人促红细胞生成素基因

本文介绍一种利用ＰＣＲ技术从基因文库中快速克隆基因组ＤＮＡ的方法。含有１０７个克隆的人基因文库分成１０份，小量提取ＤＮＡ，利用特异性的寡核苷酸引物检测ＥＰＯ基因的存在与否。经过４轮ＰＣＲ筛选，从阳性管中取１０３个噬菌体进行铺板培养，经原位杂交获得含有ＥＰＯ基因的阳性克隆。阳性克隆的插入片段被亚克隆到质粒上。酶切分析及序列分析的结果均证明我们获得ＥＰＯ基因。ＰＣＲ－筛库法可以快速从文库中获得目的基因     

Pseudomonas cepacia脂酶的分子克隆

本研究从Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ染色体文库中分离到了４个酯酶基因的阳性克隆，限制性酶切分析发现脂基因位于一个３．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上。脂酶基因的部分核苷酸序列进行了测定，并与已报道的酯酶基因序列作了比较分析，此外，还对不同物种的脂酶底物结合区域进行了讨论。     

马铃薯Y病毒小鼠中和抗体轻链基因的克隆及序列分析

从大量繁殖的Ｄ７３杂交瘤细胞中，提取制备其基因ｍＲＮＡ，并以此为模版，经反转录途径获得基因组ｃＤＮＡ，随后将其插入到λｇｔｌｌ中，构建了马铃薯Ｙ病毒小鼠单克隆抗体ｃＤＮＡ基因文库。通过免疫原位杂交，从该基因文库中筛选出含有抗体轻链基因的阳性克隆，进一步将其插入到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒中，经酶谱和ＤＮＡ序列分析确定，完整的轻链基因被获得。该基因含有９５６个核苷酸碱基［不包括Ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴］，     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的序列分析

用根据国外已报道的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）的ＲＮＡ２的序列合成的两个引物，通过对ＢＮＹＶＶ新疆分离物的ＲＮＡ逆转录获得了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白基因的ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后用Ｔ４聚合酶补平两端，克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒的ＳｍａＩ位点，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经筛选得到正向插入的重组质粒ｐＧＥＢ３。用ＰＣＲ扩增和酶切均得到５９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。用ＡＢＩ３７０Ａ型ＤＮＡ全自动序列仪测出该ｃ     

应用缩减杂交技术分离油菜叶片衰老相关基因

应用缩减杂交技术分离了油菜叶片衰老过程中表达增加的基因的ｃＤＮＡ克隆。结果表明，缩减杂交技术具有相当大的富集ｃＤＮＡ文库中目标基因的作用，能够成倍地提高ｃＤＮＡ文库目标基因的分离克隆效率。１４个在油采叶片衰老过程中基因表达增强的缩减ｃＤＮＡ克隆的核苷酸序列测定和分析结果表明，它们所代表的基因可编码的产物有１１种，ＡＴＰ硫化酶，谷氨酰胺合成酶，天冬氨酸蛋白酶，甘油醛－３－磷酸脱氢酶，细胞以素Ｐ４５０     

人胎肝cDNA中EPO基因的克隆

从人胎肝中提取得总ｍＲＮＡ，然后通过ＲＴａｓｅ反转录得到ｃＤＮＡ，利用ＰＣＲ技术克隆到ＥＰＯ基因（全长为５２７ｂＰ），经过计算机分析已知ＥＰＯ基因保守区段的限制性内切酶位点，选择ＢｇｌⅠ和ＨｉｎｃⅡ进行酶解，确认所获得ＤＮＡ片段为ＥＰＯ基因。     

猪肥胖基因(ob)位点的RFLP多态性分析

肥胖基因（ｏｂ）产物－Ｌｅｐｔｉｎ是反映体内脂肪含量和调节的重要信号因子。本研究从构建的猪脂肪ｃＤＮＡ文库中分离克隆猪ｏｂ基因,并以克隆的猪ｏｂ基因片段为探针,ＢｇｉⅡ酶切基因组ＤＮＡ,对不同品种猪在ｏｂ基因位点的多态性进行了分析。     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA片段的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及其两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆到与突变位点相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上含有至少一个与胞外多糖产生有关的基因。     

马铃薯Y病毒普通株系外壳蛋白基因的克隆与原核表达载体的构建

本研究报道马铃薯Ｙ病毒普通株系外壳蛋白基因ｃＤＮＡ克隆,全序列分析及其原核表达载体构建的结果。从感染ＰＶＹ的烟草叶片中提取病毒粒体,ＳＤＳ－酚法提取病毒核酸。以所提核酸为模板,用一对ＰＶＰＣＰ基因引物进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增了０．８０ｋｂ的特异性核苷酸片段。该片段大小五国外报道的ＰＶＹ ＣＰ基因一致,将ＰＤＲ产物插入到克隆载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中转化大肠杆菌ＤＨ５α。     

鼠伤寒沙门氏菌I相鞭毛蛋白基因fliC^i的克隆,鉴定

以提纯的鼠伤寒沙门氏菌８７０５染色体ＤＮＡ为材料，经ＥｃｏＲ Ｉ消化，过柱（ＳｅｐｈａｒｃｙｌＳ－４００），得到大于４００ｂｐ的酶切片段；然后随机克隆到质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）中，转化大肠杆菌ＬＣ２ａ（ｈａｇ＾－，ｒｅｃＡ＾－）；在氨苄青霉素平板上共得到６０１３个转化子，从中筛选出１个有动力的克隆，小量制备质粒ＤＮＡ，经酶切电泳鉴定，该克隆的外源片段大小为１５．３ｋｂ，将其命名为ｐＧＩ４０１５。     

性连锁矮小鸡（dwdw）生长激素受体（cGHR）基因突变的精确定位

本研究根据已知正常鸡的ＧＨＲ第１０个外显子和３’ＵＴＲ区的ＤＮＡ序列，设计一对引物，分别对正常农大褐鸡和矮小型农大褐鸡进行了ＰＣＲ扩增。结果正常鸡扩增片段为２０２６ｂｐ，矮小鸡为２５５ｂｐ。将矮小鸡ＰＣＲ产物克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上进行测序，精确定位了农大褐矮小鸡ＧＨＲ基因缺失突变位点。     

鸡传染性法氏囊病毒cDNA文库的建立及核酸探针的制备

利用氯化铯－蔗糖超速离心法纯化了细胞培养的鸡传染性法氏囊病（ＣＪ－８０１株）。经蛋白酶Ｋ消化，酚抽提得到的基因组ＲＮＡ在ＡＭＶ反转录酶催化下合成双链ｃＤＮＡ，通过Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ４００柱层析得到４００ｂｐ以上的大片段。将其重组到载体质粒ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ酶切位点上，转化大肠杆菌ＮＭ５２２株。通过α－互补鉴定重组体克隆，从而构建了ＩＢＤＶ的ｃＤＮＡ文库。从文库中筛选出三个重组子作为用于ＩＢＤＶ诊     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA …

以从野油菜黄单包菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及共两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆以与突变位点的相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上有含有至少一个与胞外多糖产生的     

玉米基因组Fosmid文库构建及类受体激酶基因(Psy1和Psy2)筛选

玉米(Zea mays L.)病害的发生和流行是限制玉米高产稳产的重要因素。玉米细菌性褐斑病是目前具有潜在危害性的病害之一,在抗性基因遗传规律和染色体定位研究方面取得一定进展,但在基因克隆、功能鉴定等研究上进展较为缓慢,利用构建的Fosmid文库克隆抗病候选基因是目前较为快捷和有效的方法之一。本研究以玉米细菌性褐斑病的抗病自交系F349为材料构建了玉米Fosmid文库,克隆总数约为3.7×105个,平均插入片段长度为32 kb,实现4.73倍的玉米基因组覆盖,筛选到任意基因或序列的概率达到了99.12%。基于该文库,利用不同引物组合进行了两个类受体蛋白激酶基因(Psy1和Psy2)的克隆筛选,得到14个阳性克隆,其中4个阳性克隆包含Psy2基因和Psy1基因部分片段;3个阳性克隆包含完整Psy1基因;对其中两个阳性克隆13-12F-23和32-4A-6的测序结果显示,Psy1基因的启动子和内含子分别被插入了10.0和13.5 kb的外源片段;13.5 kb的插入片段是LTR家族的huck反转录转座子,10.0 kb的插入片段是含有helitron转座元件的复杂转座子;扩增到了Psy1基因的cDNA全长,说明这两种类型反转录转座子的插入并未使基因失活。本研究为玉米基因的克隆和功能分析提供了一种可行的研究途径。     

碱性土壤基因组DNA的分离纯化和基因文库的构建

直接从广西南宁市凤凰纸业排污沟碱性土壤样品中抽提和分离纯化混合基因组DNA，所获得DNA的产量为每克土壤样品10～30pg。采用限制性内切酶EcoR1酶处理后，构建了以pGEM-3Zf( )为载体的DNA部分文库。文库的容量为23650个转化子。外源片段DNA平均大小为3．2kb。建库效率为每克环境样品获得6000个左右的含1～15kb外源随机插入片段的克隆。通过DNA序列测定和同源性比较，对从文库随机词取的16个转化子序列进行分析，发现13个外源插入片段包含序列尚未确定的DNA片段。     

油菜波里马胞质雄性不育相关线粒体基因orf224在大肠杆菌中…

本研究设计合成引物，从油菜波里马胞质雄性不育系线粒体ＤＮＡ上扩增出可能与育性有关的ｏｒｆ２２４基因５＇端（Ａ片段）和３＇端（Ｂ片段）以及全长基因（Ｃ片段）片段，并分段克隆到ｐＢＶ２２０和ｐＧＥＸ－５Ｘ－１载体上，经序列分析证实，获得了编码２２４个氨基酸基因的各序列片段。各重组菌株诱导表达产物比较分析表明，只有ｏｒｆ２２４ ３＇端即Ｂ片段融合蛋白ＧＳＴ－Ｂ得到了高效表达，其它菌株在聚丙烯酰胺凝胶电泳     

辣椒钙调蛋白cDNA克隆

本研究根据几种已克隆的植物钙调蛋白ｃＤＮＡ翻译启始密码子和终止密码子附近高度保守的碱基序列设计引物,用辣椒叶在紫外线诱导作用下表达的ｍＲＮＡ构建的ｃＤＮＡ文库为模板,通过严格的聚合酶链式反应,扩增出一条４５０ｂｐ左右的ｃＤＮＡ片段,将该片段克隆到ｐＢＳＫ（－）上并进行测序和序列分析,结果表明,所扩增到的片段为一长度为４５３ｂｐ的全长的ｃＤＮＡ,含有长度为１４８个氨基酸的开放读码框架,在碱基序列和推     

不带抗药性基因的nifA质粒的构建

本研究克隆了萤光假单胞菌ＡＳ１．５５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＳ１．５５）的亮氨酸基因（ｌｅｕ＾＋）ＥｃｏＲＩ片段（－６．６ｋｂ）,并获得含有该片段的重组质粒ｐＢＲ３２２－ＬＥＵ。从ｐＢＲ３２２－ＬＥＵ质粒中分离出ｌｅｕ＾＋ＥｃｏＲＩ片段,将其插入到ｎｉｆＡ质ｐＭＣ７１Ａ的ＥｃｏＲⅠ位点使氯霉素抗性基因失活,从而构建了不带抗药性基因ｎｉｆＡ质粒ｐＭＣ７１Ａ－ＬＥＵ。     

蜂毒溶血肽（melittin）基因的克隆及序列分析

本项研究已克隆在λｇｔ１１载体上的编码蜂毒溶血肽２６个氨基酸的基因经酶切后，亚克隆到大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ的质粒ｐＵＣ １８的ＥｃｏＲＩ和ＰｓＩ位点上，构建成重组质粒ｐＵＭ１８，然后转化感受态的大肠杆菌ＪＭ１０１之中。经对转化子中重组ｐＵＭ１８上蜂窝溶血肽基因的ＰＣＲ扩增检测和序列分析，表明克隆成功。     

新城疫北京强毒株融合糖蛋白（F）基因的克隆及序列分析

ＮＤＶ北京强毒株Ｆ４８Ｅ９经ＳＰＦ鸡胚增殖,超速离心纯化,异硫氰酸胍法提取病毒ＮＡ后,用ＲＴ－ＰＣＲ扩增,得到其融合糖白基因。将扩增产物与ｐＧＥＭ＾Ｒ－Ｔ载体相连接转化,经过ＡｍｐＩＰＴＧ－Ｘｇａｌ（ＡＩＸ）平板筛选,ＨｉｎｄⅢ酶切及ＰＣＲ鉴定,初步获得了含Ｆ基因的阳性克隆。用渐近法对克隆片段进行全序列分析,证明得到了作长１７４４个核苷酸的ＮＤＶ Ｆ蛋白基因。