绞股蓝抗TMV蛋白的分离及编码基因的序列分析*

以半叶法测定抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)活性为监控手段，采用(NH4）2SO4分级沉淀、阳离子交换及亲和层析等方法，从绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)中分离到一种抗TMV蛋白，其分子量约为27kD，N端19个氨基酸残基为DINFSLAGADGQTYNTFIA(SWISS—PROT登录号为P83206)。N端序列分析表明，它是一种新的核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)，命名为gynostemmin。gynostemmin与其它植物RIPs的N端同源性介于10％-73％之间，其中Y14F17构成植物RIPsN端的“钉子”位点；gynostemmin与葫芦科植物RIPs的同源性为31％～73％，其中F4L6A9Y14F17I18,6个残基为葫芦科植物RIPsN端“钉子”位点。根据N端序列和葫芦科植物RIPs下游保守氨基酸序列设计简并引物，采用PCR扩增并克隆了编码gynostemmin的基因，包含609个碱基，推导出的203个氨基酸残基约占成熟蛋白的75％，软件分析表明，它含有核糖体失活蛋白的活性位点区。     

杭州地区甘蔗花叶病病原鉴定

从杭州田间表现典型花叶症的甘蔗病叶中得到病毒分离物SC－ZJ，按照SCMV亚组中甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV)，玉米矮花叶病毒（Maize dwarf mosaic virus,MDMV)、高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus,SrMV)、约翰逊草花叶病毒（Johnsongrass mosaic virus,JGMV)等4种病毒基因组序列设计特性引物，对SC－ZJ进行IC－RT－PCR扩增，结果用SrMV特异性引物扩增到1条长约1.1kb的片段，而用其它3种病毒特异性引物扩增不出任何片段。扩增片段经克隆后测定序列，序列包含1135核苷酸（nt)，编码378个氨基酸（aa），取其中的近全长外壳蛋白（CP）氨基酸序列（312aa)，与SrMV、MDMV,SCMV,JGMV等4种病毒对应的序列进行同源性比较，结果核苷酸序列同源性依次为95．3％、75．2％、61．2％和53．6％，氨基酸序列同源性依次为97．1％、78．1％、72．9％和56．2％，根据IC－RT－PCR扩增鉴定及序列同源性比较结果，将SC－ZJ鉴定为SrMV。并根据CP氨基酸序列的同源性进一步分析了4种病毒的亲缘关系。     

PR—1a蛋白基因的克隆及序列分析

以珊西烟草（Nicotina tabacum cv. Xanthi-nc）的基因组DNA为模板，通过合成一对特异性引物，利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得PR－1a蛋白基因。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明：该基因由504个碱基组成，编码168个氨基酸。与已发表序列相比较，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和100％。     

菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶（SAD）基因的分子克隆

本研究以菠菜为材料，参考Ｎｉｓｈｉｄａ等人发表的ＳＡＤ基因序列，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从菠菜的总ＲＮＡ中扩增出了一条约１．３ｋｂ的片段。扩增片段克隆后进行了核苷酸序列分析，结果表明，扩增片段包含了硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因的完整阅读框。从其完整阅读框的核苷酸序列推导出的氨基酸序列来看，菠菜ＳＡＤ由３９９个氨基酸残基组成，分子量约４５．７ｋＤ，氨基端３５个氨基酸残基为其转运到叶绿体的信号肽。     

谷子脂转移蛋白cDNA的克隆及特性研究

摘要：首次报道了从谷子(Stetaria italica )未成熟种子cDNA文库中克隆到1个与其它物种脂转移蛋白（LTP）具有较高同源性的脂转移蛋白基因Siltp。将核苷酸序列和推断的氨基酸序列在GenBank中进行比较，发现Siltp与大麦脂转移蛋白LTP7a2b和LTPcw-19,玉米脂转移蛋白，欧洲油菜的脂转移蛋白基因的核苷酸序列的同源性分别为72%,70%,60%,54%；氨基酸序列的同源性分别为79%,73%，65%，57%。序列分析表明，编码区含363个碱基 ，编码121个氨基酸，其中包括26个氨基酸的信号肽序列，分子量为9.3 kD。基因组Southern杂交结果表明，Siltp在基因组中以单拷贝存在。Northern杂交研究Siltp的时空表达特异性，发现Siltp仅在茎、叶、穗中表达。利用软件PAUP对17种植物的LTP进行进化分析，从进化系统树可以看出LTP有4个分支，其中，小麦发生分化较早，其它几种单子叶植物如玉米、谷子、大麦和水稻分化较晚，说明发生了早期的基因复制事件。在整个系统图中，双子叶比较分散，说明LTP基因的进化是个复杂的过程；禾本科作物的脂转移蛋白基因是由一个原始基因分化而产生的不同分支，Siltp与大麦LTP亲缘关系最近。     

黄瓜花叶病毒M株系RNA3的变异分析及全长克隆的克建

为了探讨由多年地理环境变化引起的黄瓜花叶病毒Ｍ株系ＲＮＡ３的核苷酸序列变异状况，对其ＲＮＡ３的序列作了再次测定。结果表明，ＭＸ－ＲＡ３全长为２２１５个核苷酸，具有两个阅读框，即３ａ和外壳蛋白编码区。与Ｍ株系相比总共有８个核苷酸发生变异；３ａ和外壳蛋白中各有一个氨基酸发生改变。     

猪5-HT4b受体基因cDNA克隆和序列分析

利用RT—PCR技术克隆了猪5-HT4bR基因的核苷酸序列，并利用生物信息学手段进行了验证。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长1209bp且包含一个完整的开放阅读框，编码402个氨基酸。该序列已在GenBank登录（Accession No．AY566638）。序列分析结果表明，该基因与已报道的人、鼠等5种动物5-HT4bR基因具有较高的核酸序列和氨基酸序列同源性，分别为92．56％和93．63％。该基因编码的蛋白具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体超家族。     

新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶基因的序列分析

报道了新城疫病毒（ＮＤＶ）中国标准强毒Ｆ４８Ｅ８株血凝素－神经氨酸酶（ＨＮ）基因的核苷酸序列及据此推导的氨基醉序列。该基因长１８６０ｂｐ,编码区长１７１３ｂｐ,编码５７１个氨基酸。氨基酸序列中,有一由２３个氨基酸组成的疏水性跨膜结构、１３个半胱氨酸残基和５个可糖基化位点。Ｆ４８Ｅ８株与Ｉｔａｌｉｅｎ株、ＴｅｘａｓＧＢ株的氨基酸同源性分别为９３．３％和９１．１％。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank中猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(porcine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)cDNA序列，设计1对引物。应用RT-PCR，分别从经过植物血凝素-P(PHA-P)或刀豆蛋白A(ConA)诱导的猪外周血单核细胞总RNA中扩增得到了猪GM-CSF cDNA，将其与pGEM-T Easy载体连接，经转化、筛选阳性克隆，进行了核酸序列测定。对核苷酸序列和推导的氨基酸序列分析表明，猪GM-CSF前体蛋白编码区由435bp组成，编码144个氨基酸，其中N端信号肽有18个氨基酸。在第44、47和54位氨基酸处有3个糖基化位点。与人、牛、羊、小鼠的GM-CSF核苷酸序列的相似性分别为82％、85％、88％和86％，氨基酸序列相似性分别为72％、73％、73％和57％。与人、牛、羊GM-CSF的亲水性和疏水性氨基酸的分布保守性很高，而与小鼠的差异较大。     

花生矮化病毒(PSV) Mi株系 RNA3全序列分析

完成了中国花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)Mi株系RNA3全序列分析。PSV—MiRNA3全长2170个核苷酸，含两个开放阅读框架(ORE)，分别编码3a运动蛋白和壳蛋白(CP)。PSV-MiRNA3核苷酸序列和PSV亚组IER和J株系同源性为77．7％和78．5％，与亚组ⅡW株系同源性为76．7％；同一亚组ER和J株系RNA3序列同源性为91％。PSV—Mi3a和cp基因与PSV-ER，J and W株系同源性分别为78．3％～79．3％和74．4％～77．8％。PSV-Mi 3a和CP蛋白氨基酸序列与PSV-ER，J and W株系同源性分别为73．90%-77．4％和64．80%-77．5％。PSV-Mi RNA35’UTR和IR区域有较大的变异性，与PSV—ER，J and W株系序列同源性分别为78．4％79．8％和70．2％。73．2％，明显低于亚组Ⅰ、Ⅱ两个亚组间株系在这两个区域序列同源性。上述结果说明我国PSV Mi株系不同于已报道的PSV两个亚组，独自构成一个新亚组，即亚组Ⅲ。     

烟草Ⅰ类几丁质酶,β—1,3—葡聚糖酶cDNA的克隆和序列分析

我们以烟草花叶病毒感染７天后的三生烟为材料，对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶和Ⅰ类β－１，３－葡聚糖酶ｃＤＮＡ进行了克隆和序列分析。结果表明，Ｃｈｉ－Ｉ，Ｇｌｕ－－Ⅰ的全长ｃＤＮＡ分别为９９０ｂｐ和１０２０ｂｐ。另外，核苷酸及由此推断的氨基酸序列与文献报道的序列相比较，分别具有Ｃｈｉ－Ⅰ：９９．９％ＧＮＧ ９９．７；Ｇｌｕ－Ⅰ：９９．６％与９９．４％的同源性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ—4株全基因组序列测定与分析

在国内首次完成了猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株的全基因组序列测定。用RT－PCR方法分段扩增出PRRSV北京地区分离株BJ－4株的21条cDNA片段，分别克隆于pGEM-T-easy质粒载体并进行测序，按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV BJ－4株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSV BJ－4株基因组全长15504b，包含8个开放阅读框，5′端有190nt先导序列；3′端有256ntUTR，其中包括95ntPoly(A)尾。PRRSV BJ－4株与美洲型毒株VR－2332和Nebreska的核苷酸同源率分别为99．5％和98．4％，而与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源率为62．5％，与另一国内分离株CH－1a株编码构蛋白基因的核苷酸同源率为93．3％。     

斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltNPV）碱性核酸外切酶基因的序列分析

斜纹夜蛾核多角体病毒碱性核酸外切酶基因（alk-exo)定位于基因组的XbaI-I片段上，克隆并测序确定了alk-exo全序列：SpltNPV碱性核酸久切酶基因的完整的读码框为1227个核苷酸。编码一长为408个氨基酸的蛋白质。在距起始密码子ATG上游－37位、－80位各有一个启动子基序TATA框，在－28位有杆状病毒晚期基因的启动子基序TAAG，在ORF终止区有加尾信号poly(A)序列AATAAA。根据核苷酸序列推导的蛋白质的分子量为47kD，等电点为8．9，在296－312位氨基酸存在有一预期跨膜区，其中心位于304位的丙氨酸（GFYYSFGALVCVFCMK）。SpltNPV的alk-exo氨基酸序列与其它8种杆状病毒的alk-exo同源性在37％－43％之间，且与疱疹病毒的alk-exo基因有一定的同源性，通过对8种杆状病毒和疱疹病毒的alk-exo序列比较发现了5个保守区。     

黄瓜花叶病毒赤豆分离物外壳蛋白基因序列分析及原核表达

根据已报道的黄瓜共上壳蛋白基因序列合成引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了我国黄瓜花叶病毒赤豆分离物的外壳蛋白基因,序列分析表明,外壳蛋白基因全长６５７个核苷酸,编码２１８个氨基酸,其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组１的分离物有极高的同源性。     

改变天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶调控活性提高玉米中游离赖氨酸含量

以烟草(Nicotiana tabacum var．samsum)叶片为材料，提取RNA，分离mRNA，进行RT-PCR扩增编码二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的cDNA片段。序列分析表明，得到971个核苷酸的片段。与发表的序列相比，成熟蛋白N-端编码区缺失了21个核苷酸，且第627位核苷酸发生了C到T的改变，但没有引起氨基酸的变化。将ahaps cDNA编码区的第410和411位核苷酸由AC突变为TT，这一突变使DHDPS成熟蛋白的第104位氨基酸由天冬酰胺变为异亮氨酸。以玉米(Zea mays L．)总DNA为模板，PCR扩增DHDPS叶绿体转运肽的编码序列，序列分析结果显示，扩增片段中含有DHDPS转运肽完整编码区162个核苷酸及成熟蛋白N-端编码区21个核苷酸。将突变后的础(天冬氨酸激酶)基因和dhdps cDNA与CaMV35S启动子、转运肽序列及潮霉素抗性基因连接，构建表达载体pRHAK和pRHDH，用基因枪轰击法将pRHAK和pRTDH转入玉米胚性愈伤组织，得到再生植株。经分子检测证明，目的片段已整合到玉米基因组中。T1代植株的游离氨基酸含量测定显示，部分转入础基因的植株中，叶片和种子中游离苏氨酸的含量提高3～5倍。部分转入dhdps cDNA的植株中，叶片和种子中游离赖氨酸含量分别提高了4倍和1倍。     

水稻瘤矮病毒基因组S8片段全序列测定及其结构分析

应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）中国广东信宜分离物（RGDV-C）的基因组S8片段，并测定了全序列。结果表明RGDV-C基因组s8片段全长1578bp（GenBank登录No．AY216767），含有一个ORF，编码一个含有426个氨基酸的外层衣壳蛋白，基因结构与泰国的RGDV分离物基本一致，核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为96．0％和99．1％，与植物呼肠孤病毒属（Phytoreovirus）的三叶草伤瘤病毒（Wound tumor virus，WTV）和水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus,RDV）各分离物的核苷酸同源性分别为56．8％和55．3％～56．0％。从s8编码的外层衣壳蛋白亲缘关系、反向重复序列、病毒粒体被严格限制于薄壁细胞以及致瘤特性来看，RGDV与WTV比RGDV与RDV具有更近的亲缘关系。     

刺参核糖体蛋白L17基因(RPL17)全长cDNA克隆及组织表达

核糖体蛋白除组成核糖体、参与蛋白质合成之外,还作用于细胞的分裂、增殖、分化、凋亡、发育调控等过程.为了研究核糖体蛋白基因在刺参中的生理功能,本研究采用全长cDNA克隆技术首次从刺参(Apostichopus japonicus)体壁中克隆出核糖体蛋白L17基因(ribosomal protein L 17,RPL17)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JQ922561).该基因cDNA全长643 bp,包括33 bp的5’-UTR,58 bp的3’-UTR,开放阅读框552 bp,编码183个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为21.5010kD,理论等电点(pI)为10.29,总平均亲水性(GRAVY)为-0.964,为不稳定的亲水蛋白.在NCBI网站上经Blastn和Blastx比对分析,发现该序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与其他物种的同源性均在70％以上,其中与紫海胆(Stron-gylocentrotus purpuratus)的同源性分别为75％和81％.二级结构预测结果:α螺旋占36.61％;β折叠占7.65％;无规卷曲占42.08％;其余13.66％为延伸链.蛋白功能位点分析显示其含有1个核糖体蛋白L22信号位点和9个磷酸化位点,其中cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点3个,蛋白激酶C磷酸化位点4个,酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点2个.构建的系统进化树显示,刺参与同为棘皮动物的紫海胆聚为一支,分子进化地位上关系最近,其次聚类顺序较近的为玻璃海鞘、非洲爪蟾,脊椎动物聚为一支,该结果与这些物种在生物学上的分类是较一致的.利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测RPL17基因在刺参各组织中的表达,结果表明,RPL17基因在体腔细胞中表达量最高,肠中次之,呼吸树中最低.体腔细胞中的表达量分别为肠、体壁、纵肌、呼吸树的5.67、21.63、43.25和346倍,与4种组织的差异均极显著(P＜0.01).另外,肠与呼吸树中的表达量差异显著(P＜0.05),其余组织差异不显著(P＞0.05).本研究结果将为进一步研究刺参蛋白质合成、再生及多种生理活动的调控机制提供基础数据.     

水稻黑条矮缩病毒玉米分离物基因组S8和S9的序列分析及其原核表达

通过RT-PCR获得了玉米粗缩病病毒湖北分离物(Hbm)基因片段S8和S9的全长cDNA克隆，并测定了它们的全序列。S8全长1936bp，其编码链只含1个ORF，编码1个由591个氨基酸组成、分子量约为68kD蛋白；S9全长l900bp，含有两个非重叠的ORF，分别编码由347个和209个氨基酸组成、分子量分别约为40kD和24kD蛋白。序列分析表明，Hbm-S8和S9与水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)中国不同分离物之间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94．4％～98．9％和96．0％~99．0％，且与日本RBSDV的序列同源性高于与玉米粗缩病毒相应片段的序列同源性，进一步证明了引起我国玉米粗缩病的病原为RBSDV。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，RBSDV8和9编码的蛋白可在大肠杆菌(Escherichia coil)中高效表达。以这些蛋白为抗原，制备了抗血清。用Western blot方法在感病的玉米(Zea mays)植株中可检测到RBSDV-Hbm S8和S9 ORF1编码的蛋白。     

山羊TNFα成熟肽氨基酸序列分析

采用RT－PCR技术扩增出山羊TNFα成熟肽基因（cDNA），并进行序列测定。本实验扩增的TNFαcDNA含576个核苷酸，其中成熟多肽由474个核苷酸组成。由此cDNA序列推导出了相应的TNFα氨基酸残基。山羊TNFα成熟肽含157个氨基酸，与人和绵羊的氨基酸数目相同；山羊与绵羊、猪、人和小鼠的TNFα成熟肽氨基酸的相似性分别为98.1%、86.0%、81.5%与75.2%。     

猪伪狂犬病病毒GB株蛋白激酶(PK)基因的克隆及序列分析比较

以伪狂犬病病毒GB株细胞培养物为模板，用PCR方法扩增蛋白激酶(PK)基因，对其进行了克隆、序列测定，并与PRV NIA-3株、Ka株和其他α-疱疹病毒进行了同源性比较。结果显示：所扩增的PK基因片段长1396bp，该片段包含一个开放阅读框(ORF)，长1005bp，编码由334个氨基酸组成的蛋白质。与NIA-3株及Ka株的核苷酸同源性为98．4％和97．5％，基因编码区氨基酸序列的同源性为98．2%和96．4％。具有真核细胞丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶氨基酸亚结构域特征序列，而且α-疱疹病毒PK基因具有一些特征性的、共有的氨基酸序列。为今后研究PK基因的功能和构建PK缺失株奠定了基础。