嵌合型猪圆环病毒（PCV1—2）及PCV2 ORF2真核表达质粒对商品猪的免疫保护

应用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒（PCV1—2）及真核表达质粒pcDNA3．1／V5-His-ORF2作为免疫原免疫母源抗体ELISA效价在0．07～0．60不等的商品猪,9头猪随机分为4组,1组（3头）肌肉注射免疫10^3.5 TCID50的PCV1-2／头,2组（2头）肌肉注射真核表达质粒200μg／头,3组（2头）肌肉注射空载体（pcDNA3．1）200μg／头,4组（2头）不免疫作为攻毒对照组。于免疫后42d,PCV1—2组及真核表达质粒组产生了PCV2抗体。免疫后42d所有组攻毒PCV2和PRRSV,剂量分别为2×10^4.5 TCID50／头和10^6 TCID50／头。攻毒后21d,攻毒对照组猪淋巴结比免疫组显著肿大,免疫组猪血清、淋巴结中PCV2病毒栽量低于对照组,攻毒对照组猪淋巴结中PCV2抗原含量高于免疫组。这些结果表明,嵌合型PCV1-2及真核表达质粒肌肉注射免疫商品猪后,对PCV2感染能产生保护性免疫应答,有可能成为候选疫苗。     

猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2/猪白介素-2(PoIL-2)嵌合重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性ELISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3.1/ORF2质粒;在rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒或rpcDNA3.1/ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒为下一步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2／猪白介素-2（PoIL-2）嵌合重组表达质粒（rpcDNA3．1／PCV2-linke PoIL-2）在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3．1／PCV2-linker-PolL2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc）亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性EI。ISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3．1／PCV2qinker-PolL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3．1／oRF2质粒;在rpcD—NA3．1／PCV2-linkePolL-2质粒或rpcDNA3．I／ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3．1／PCV2-linkerPoIL-2质粒为下-步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列，设计合成了1对引物，对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增，将扩增的ORF1基因克隆入pMD18～T载体，获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢ C得到重组子，命名为pBAD／gⅢ—ORF1。序列分析表明，克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99．5％；与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92．1％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为90．2％～99．5％。同时，测序结果表明，克隆的ORF1准确插入了pBAD／gⅢC的多克隆位点，未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析，结果表明PCV-2ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子质量约为41ku。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及活性研究

根据猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因(oRF2),经Bam H Ⅰ/HindⅢ双酶切后将其克隆到表达载体pQE30中并转化大肠埃希菌JM109,采用IPTG进行诱导表达,采用自行创新的纯化方法对表达的融合蛋白进行纯化,Western blot鉴定纯化后的重组Cap蛋白(rCap)活性.结果表明,成功克隆了无核定位信号的ORF2基因,其分子质量大小为579 bp;表达的rCap蛋白大小为24.1 ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的rCap蛋白纯度在95%以上;Western blot鉴定结果表明,Cap蛋白可以和抗PCV-2抗体反应,具有很好的抗原性.本研究为进一步建立以Cap蛋白为包被抗原的PCV-2间接ELISA诊断方法以及PCV-2疫苗的研究奠定了基础.     

猪圆环病毒2型(PCV2)感染:临床症状、病理学及实验室诊断

临床症状和病理学特征仍然是怀疑和诊断PCV2感染相关疾病的基石。随着时间推移,对该病毒感染的临床病理认识不断增加。从最初报道的断奶仔猪多系统衰竭综合征,到一些肠道、呼吸道和繁殖紊乱都与PCV2有关。一种免疫复合性疾病,猪皮炎与肾病综合征也与这种病毒感染有关。这些疾病一起被归入猪圆环病毒病(PCVD)或猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。感染PCV2的猪发展成为PCV2亚临床感染或临床PCVD/PCVAD的具体机制还有待阐明,但是对田间基本样本的基于临床、解剖和组织病变的观察有助于揭示该病毒感染的致病机理。本综述目的是更新现有对于PCV2感染的临床、病理以及它们的诊断方法的认识。此外还提出了统一的PCVD/PCVAD命名方法的提议,并给出了确切的诊断标准。     

猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达

为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni²⁺离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。     

猪圆环病毒2型及3型快速二重PCR检测方法的建立及其应用

针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)基因的保守序列设计了2对扩增PCV2和PCV3的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV2和PCV3的二重PCR检测方法。敏感性和特异性结果显示,1.08×10~(-8)μg/μL是对PCV2和PCV3的最低检测限具有较好的灵敏度;而对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、大肠杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带,表明所建立的方法具有较好的特异性。应用该方法检测了2017年9月—2018年8月从广西14个地市猪场采集的533份病猪死猪内脏组织,结果显示:PCV2阳性率为23.8%,PCV3阳性率为14.8%, PCV2和PCV3混合感染率为2.8%。广西14个地市中有12个地市的猪场送检样品检测出PCV2,有10个地市的猪场送检样品检测出PCV3,表明PCV2和PCV3在广西受检猪群中普遍存在,要重视和做好PCV2和PCV3感染的防控工作。     

猪圆环病毒2型合成肽疫苗佐剂筛选与免疫保护性研究

【目的】筛选更安全高效的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)合成肽疫苗佐剂。【方法】将IMS 251C VG、GEL 02 PR、ISA 15A VG、ISA 206 VG、ISA 61 VG、台湾细菌鞭毛、卡波姆、多糖共8种佐剂与适量PCV2多肽抗原按照特定方法配制成不同疫苗,并验证其物理性状,采用小鼠试验初步检验疫苗安全性及免疫效果,筛选出较优的佐剂进行仔猪免疫攻毒保护试验,进一步评估各疫苗的免疫保护效果。【结果】物理性状显示,所有疫苗稳定性均较好,4℃保存期均超过12个月。ISA 61 VG油佐剂黏度较高且乳滴粒径较大,ISA 15A VG、ISA 206 VG双相佐剂次之,其余水佐剂均较低较小。小鼠试验结果显示,除台湾细菌鞭毛佐剂外其他佐剂安全性均良好;小鼠ELISA抗体水平检测结果显示,ISA 61 VG、GEL 02 PR、ISA 206 VG组免疫效果明显高于其余疫苗组;综合评定安全性和免疫效果,筛选ISA 61 VG、GEL 02 PR、卡波姆、多糖、ISA 206 VG共5个佐剂组进行仔猪免疫攻毒保护试验。仔猪免疫攻毒保护试验...     

猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。     

Vaccination with inactivated or live-attenuated chimeric PCV1-2 results in decreased viremia in challenge-exposed pigs and may reduce transmission of PCV2

The objectives were to determine transmissibility of PCV2 to na?ve contact pigs 140 days after infection of resident pigs and the benefit of vaccination with live-attenuated or inactivated chimeric PCV2 vaccines on chronic PCV2 infection. Twelve 6-week old PCV2 na?ve pigs were randomly divided into four groups of three pigs: negative controls, positive controls, and pigs vaccinated with either a live-attenuated or inactivated chimeric PCV1-2 vaccine. All animals were bled weekly and tested for anti-PCV2 antibodies and PCV2 and PCV1-2 DNA and all groups except negative controls were challenged at 10 weeks. Two pigs vaccinated with the live PCV2 vaccine were PCV1-2 viremic at a single observation point. Both vaccine regimens induced an anti-PCV2 antibody response which was detected sooner and reached a higher level with the commercial inactivated vaccine. Both vaccines significantly decreased the concentration and duration of PCV2 viremia compared to the positive controls. PCV2 DNA was detected in lymphoid tissues of 1/3 pigs in the live-attenuated vaccine group and 3/3 positive control pigs. Three, 2-week old, PCV2 na?ve contact pigs were comingled with each group at 168 days post-vaccination or 140 days post-challenge. After seven days of co-housing, the resident pigs were removed and the contact pigs remained for six weeks. Evidence of chimeric PCV1-2 vaccine or PCV2 challenge virus transmission to na?ve contact pigs was lacking in all groups. The results of this study suggest that 140-day closure of a small pig population in a controlled environment may result in stabilization and elimination of PCV2.     

Induction of protective immunity by topic application of a recombinant adenovirus expressing rabies virus glycoprotein

The objective of this study was to determine if a replication defective recombinant adenovirus expressing rabies virus glycoprotein (Adrab.gp) given through a non-invasive vaccination route (by topical application) onto the skin (NIVS) could elicit an immune response and/or protection against rabies. Groups of mice were immunized by NIVS with various doses of Adrab.gp. For comparison, groups of mice were immunized intramuscularly, subcutaneously, or intradermally with Adrab.gp. Mice received two booster immunizations at 1 and 2 months after the first immunization. Virus neutralizing antibody (VNA) titers were measured at day 21 after the first and second immunizations and at day 14 after the third immunization. Fifty percent of the mice immunized by NIVS with 2 x 10(7) and 2 x 10(8)pfu Adrab.gp vaccine developed VNA, whereas none of the control mice or the mice immunized by NIVS with the lowest dose (2 x 10(6)pfu) of Adrab.gp virus developed VNA. However, this low dose induced high titers of VNA in mice immunized by parenteral routes. Two weeks after the last immunization, all the mice were challenged with a lethal dose of rabies virus. More than 70% of the animals immunized by NIVS with > or = 2 x 10(7)pfu Adrab.gp virus survived the challenge, whereas all the mice in the negative control group and the group immunized by NIVS with the lowest dose of Adrab.gp succumbed to rabies. Taken together, the results suggest that NIVS with Adrab.gp can induce VNA production and protection against lethal challenge with rabies virus in mice.     

马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价

为评价马流感病毒(EIV)HA基因核酸免疫效果,本研究以甲病毒复制子载体pSFV1CS分别构建了表达EIV H3N8亚型的美洲型和欧洲型HA基因的重组真核表达质粒。并将其转染293T细胞,经间接免疫荧光鉴定表明HA基因获得表达;以重组质粒免疫的BALB/c鼠能够检测到特异性抗体产生,而且HI抗体水平持续升高,同时小鼠体内IFN-γ、IL-4分泌水平也有所升高。攻毒后小鼠表现轻度临床症状,但病毒分离和RT-PCR均未检测到病毒。上述结果表明,该重组质粒pSFV1CS-EIV-HA具有良好的免疫原性并且可以诱导免疫动物产生较高免疫应答的能力。     

鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究

本研究旨在评价表达新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗的免疫持续期和加强免疫对疫苗免疫效力的影响。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日龄SPF鸡,103PFU/羽,7d即可检测到NDV HI抗体应答,对NDV强毒F48E8株攻毒保护率达100%。一次免疫18周后,对NDV强毒攻击依然提供完全保护。鸡痘病毒（FPV）疫苗免疫4周,再接种rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保护率降低至50%。相反,rFPV-12LSHN免疫4周,随后二次免疫可显著提高对NDV的体液免疫应答水平（P〈0.01）,对NDV强毒攻击的保护率仍然为100%。结果表明,表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周,rFPV-12LSHN的二次免疫可以提高疫苗的免疫力。     

Use of a Sindbis virus DNA-based expression vector for induction of protective immunity against pseudorabies virus in pigs

Injection of plasmid DNA encoding pseudorabies virus (PRV) glycoproteins into pig muscle has been shown to result in protective immunity against lethal infection. Nevertheless, such DNA vaccines are still less efficient than some attenuated or killed live vaccines. One way to increase DNA vaccine efficacy is to improve the vectorisation system at the molecular level, thereby enhancing the rate of in vivo-produced immunogen protein and consequently specific acquired immunity. The present study compared the effectiveness of the protein expression system depending on Sindbis virus (SIN) replicase [J. Virol. 70 (1996) 508] with that of more classical pcDNA3 plasmid. Pigs were vaccinated twice at 3-week interval with a mixture of three pcDNA3 plasmids expressing gB, gC and gD (designated as PRV-pcDNA3) or a mixture of three SIN plasmids expressing the same glycoproteins (PRV-pSINCP), and were challenged with a highly virulent PRV strain. The two DNA vaccines induced PRV-specific T cell-mediated immune response characterized by very low levels of IFN-gamma mRNA in PBMC after in vitro antigen-specific stimulation. Very low levels of neutralizing antibodies (NAb) were also obtained in sera following DNA injection(s). A second DNA injection did not boost immune responses. After a lethal challenge, high levels of IFN-gamma mRNA and high NAb response were induced in all DNA-vaccinated pigs, regardless of the vector used. Therefore, the two eukaryotic expression systems showed comparable efficacy in inducing antiviral immunity and clinical protection against PRV in pigs. This suggests that SIN DNA-based vector immunizing potential may differ according to antigen and/or host.     

表达新城疫病毒F HN基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性和免疫效力试验

目前我国主要使用全病毒灭活苗和弱毒活疫苗免疫接种预防新城疫(ND)，虽然这两种疫苗都能产生较好的保护力，但是也存在一些不可克服的缺陷。因此迫切需要研制新型高效疫苗用于防制该病。国内外很多学者都在进行着ND各种基因工程疫苗的研制，NDV—F、HN基因在多种载体中得到表达并取得了较好的保护效力。本实验室已构建了表达NDV F18E8株F、HN基因的重组疫苗rFPV—F、rFPV—HN。本研究对这两种重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性以及对SPF鸡和商品鸡的免疫保护作用进行了评价。     

重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化

参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。     

用套式PCR方法对几种猪用冻干疫苗的PCV2检测

参照Genbank已发表的猪圆环病毒2型的基因序列,取其比较保守的基因片段ORF2,利用引物设计软件Oli-go5.0设计两对PCV2型特异的引物,其中第一对引物扩增跨度为ORF2全基因片段,长度为702 bp,第二对引物扩增ORF2中间的一个小片段,跨度大小为494 bp.首先用第一对引物扩增阳性DNA,阳性DNA的浓度从10-1稀释到10-11,然后以第一次PCR产物为模板,用第二对引物进行PCR,发现这种套式PCR的方法比用普通PCR灵敏度提高102倍.同这种套式PCR方法对广东省市场上出售的几种猪用弱毒疫苗进行猪圆环病毒2型检测,结果发现这几种疫苗全部为阴性,本实验说明目前广东市场上出售的弱毒疫苗在制作过程中没有受到PCV2的污染,解除了广大猪场主的顾虑.