砀山酥梨果实COMT基因的克隆和表达分析

梨果实石细胞的发育和木质素的合成、转运及沉积密切相关。咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)是木质素合成途径中的1种关键酶,主要参与紫丁香基木质素(syringyl lignin,S-木质素)的生物合成。本研究以砀山酥梨果实为材料,利用RT-PCR技术并结合RACE方法,得到砀山酥梨COMT基因的全长c DNA,命名为Pb COMT(Gen Bank登录号为KC905086)。该基因全长1 371 bp,开放阅读框为1 098 bp,编码365个氨基酸。进化树分析发现砀山酥梨COMT蛋白具有很高同源性,与苹果的相似性达到94%。将该基因重组到表达载体p ET-32a(+)中进行原核表达,电泳检测到1条大约60.0 k D的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。荧光定量表达分析得知,梨果实Pb COMT基因表达量变化与木质素的含量变化趋势基本一致,并且和石细胞发育规律有很大的相关性。本研究为阐明梨石细胞发育分子机理奠定基础,为分子调控石细胞含量、改善梨果实口感提供了科学依据。     

砀山酥梨肉桂酸4-羟化酶基因的克隆及表达分析

木质素是梨(Pyrus)石细胞的重要成分之一,木质素合成代谢对石细胞形成发育有着重要影响.肉桂酸4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H,EC l.14.13.11)是细胞色素单加氧酶超家族中CYP73A亚家族的一员,同时为木质素合成代谢中的一个关键酶.本研究从砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Danshan Su)果实中克隆出一条肉桂酸4-羟化酶基因的全长cDNA序列,命名为PbC4H,GenBank登录号为:KF663548.PbC4H全长1 764 bp,具有1 515bp的ORF,编码504个氨基酸.PbC4H与多个物种C4H基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性,说明其在进化过程中较为保守.结构域分析表明,PbC4H具有跨膜结构域和典型的细胞色素P450结构域特征.qRT-PCR分析发现在梨果实发育的不同时期,PbC4H基因表达量呈现先增加后下降的趋势,其中在花后55 d达到最高.构建了PbC4H原核表达载体pET-32a-PbC4H,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21菌株中诱导表达出PbC4H融合蛋白.亚细胞定位表明PbC4H蛋白定位于细胞膜上.本研究结果为利用分子生物学技术调控梨木质素的合成和石细胞的发育提供了基础资料.     

泸定百合过氧化氢酶(Ls-Cat1)基因的克隆及表达分析

过氧化氢酶(CAT)参与植物的多种胁迫反应。为探究百合中的CAT基因与百合抗镰刀菌病害的关系,根据百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的CAT基因中间序列片段,通过RACE结合RT-PCR技术从泸定百合中克隆到1个CAT基因全长c DNA序列,该基因全长1 743 bp,包含1个1 479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,命名为LsCat1(Gen Bank登录号:KU355272)。序列比对分析表明,Ls-Cat1编码的氨基酸序列中包含已确定的CAT保守基序。系统进化树分析显示,Ls-Cat1与其它物种CAT基因编码的氨基酸序列具有较高的相似性。qPCR结果显示,Ls-Cat1经百合镰刀菌诱导后明显上调表达,推测该基因可能与百合抗镰刀菌病害相关。本研究结果为揭示百合对镰刀菌枯萎病的抗病分子机制提供了一定的理论依据。     

侵染新疆甜瓜的ZYMV衣壳蛋白基因克隆及其序列分析

新疆作为中国有名的瓜果之乡,其瓜类不仅成为其中最具代表性的品牌也日益成为农民增收致富的经济支柱产业.然而近年来由于新疆瓜果日益受到病毒病威胁,严重时造成大面积减产甚至绝收,大幅度制约了农民生产积极性和生活水平的提高.小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaicvirus,ZYMV)是其中比较具有代表性的病毒,为了对新疆不同主栽地区甜瓜(Cucumis melo) ZYMV进行生物防治和抗病毒甜瓜的研究.本研究利用同源克隆的方法,扩增获得了新疆19个样点ZYMV分离物衣壳蛋白(coat protein,CP)基因全长序列,ZYMV分离物CP基因全长介于1 080～1 180 bp,编码253～301个氨基酸,蛋白质大小约33 kD.序列比对发现,ZYMV核酸序列的3'和5'非编码区末端保守性较低,编码区及其周围序列保守性较高,氨基酸序列的N端保守性高于C端.ZYMV同源性比对结果发现,病毒属于同一ZYMV基因型.通过核酸序列构建的分子进化树可以将ZYMV分为4个亚组,亚组分离依据符合地区分布特性.根据对蛋白质理化性质,包括蛋白质的动力学、化学和热力学稳定性分析得出,ZYMV均属于稳定性蛋白.结合新疆夏季平均降水量和平均气温变化趋势发现,其与对应地区ZYMV CP的疏水性指数和脂溶性指数的变化趋势存在一定相关性.分析认为,不同地区ZYMV CP的稳定性存在一定的差异,这可能与新疆特殊的气候条件与分离物所处地理环境有关.本研究通过序列分析获得19个样点ZYMV CP核酸序列以及CP特征,为今后以RNA干扰技术或基因组编辑技术培育抗病毒甜瓜,进行生物农药研发等提供了基础的数据支持,同时为开展对植物病毒的致病机理以及探究环境与病毒传播机制的研究提供初期的研究方向.     

兰州百合和大花卷丹远缘杂交胚挽救技术研究

利用兰州百合与大花卷丹进行正反交,研究了花期调控、不同授粉方式、蒴果采收时间及胚挽救培养基配方对杂种胚萌发率及成苗率的影响。结果表明,兰州百合延后种植及大花卷丹提前种植,可有效地解决花期不遇的问题;兰州百合与大花卷丹杂交授粉时,花期授粉的蒴果膨大率可达93.3%,种子有胚率为2.00%;大花卷丹与兰州百合杂交授粉时,切割柱头的授粉膨大率最高,仅为7.6%,但种子有胚率为0%。兰州百合与大花卷丹杂交授粉后60～70 d的蒴果进行胚培养较为适宜。兰州百合与大花卷丹的杂交胚适宜培养基为MS+0.3 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA。     

甘肃红豆草BAN基因克隆与双标记选择表达载体构建

为探讨编码花青素还原酶BAN基因的功能及其与缩合单宁合成的关系,根据BAN基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术获得甘肃红豆草BAN的相似基因;利用生物信息学相关软件分析,预测其c DNA序列编码的蛋白质结构和功能;采用Real-time PCR法检测该基因在甘肃红豆草各组织中的表达;构建含有BAN基因的双标记选择载体。结果表明,克隆的BAN基因与报道的BAN基因序列相似性达到99.41%,其ORF长为1 020 bp,可编码339个氨基酸残基,具有花青素还原酶保守结构域和重要功能位点;三级结构预测显示,预测模型与花青素还原酶单体结构(C2RH8A)相似,属于短链脱氢/还原酶超家族成员,表明其可能具有花青素还原酶的功能。BAN基因在各组织中均表达,其表达量依次为荚果、叶、蕾、花、茎。以此为靶序列,构建携带抗除草剂bar和绿色荧光蛋白GFP基因的双标记选择植物表达载体,将为缩合单宁合成、代谢的进一步研究及抗除草剂和抗臌胀病牧草新品种的培育奠定基础。     

西藏牦牛mtDNA 16S rRNA基因的克隆及其遗传多样性分析

本研究首次通过克隆、测序获得了11个西藏牦牛类群共111头个体的mtDNA 16S rRNA基因全序列,并分析了西藏牦牛的遗传多样性、分类关系、起源和分化,为进一步保护和合理利用西藏牦牛遗传资源以及探讨牦牛类群的划分提供分子依据。结果表明：西藏牦牛16S rRNA基因全序列长度为1571 bp或1570 bp（LWQ4）;G＋C平均含量37.8%,具有明显的碱基偏倚性;平均核苷酸多样性（Pi）为0.00291,平均单倍型多样性（Hd）为0.8501±0.0009,111个样本共发现48种单倍型并聚为2簇,表明西藏牦牛具有较高的遗传多样性并存在2个母系起源;Kimura双参数遗传距离范围为0.00098-0.00694,11个西藏牦牛类群划分为2大类：嘉黎牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、工布江达牦牛、帕里牦牛、斯布牦牛、康布牦牛、桑桑牦牛、江达牦牛、桑日牦牛为一类,类乌齐牦牛单独为一类。本研究发现类乌齐牦牛具有较丰富的遗传多样性,并且发现了一个序列特异个体LWQ4,需要对其进行更深入的研究。牛种间的聚类结果显示,西藏牦牛与美洲野牛的亲缘关系最近,与普通牛、水牛的亲缘关系相对较远,本研究支持将牦牛从牛属（Bos taurus）中分离出来,作为一个独立的牦牛属（Poephagus）的观点。     

禾本科植物富甲硫氨酸蛋白基因的克隆及其进化分析

甲硫氨酸(Met)是豆科植物的第一限制性氨基酸。为了获取富Met贮藏蛋白基因,通过比对禾本科富Met贮藏蛋白基因序列来设计引物,以千金子、芦苇、稗、光头稗、东乡野生稻、茶陵野生稻和湖南野生稻等几种常见禾本科植物种子RNA为模板,经RT-PCR扩增获得c DNA片段,并进行序列比对、Motif预测和进化分析。测序结果显示,禾本科植物富Met贮藏蛋白基因序列存在保守程度不同的区域,在同一个属内的植物间,富Met贮藏蛋白基因的序列高度保守。Motif预测显示,富Met贮藏蛋白可能与植物抗病性等功能有关。进化分析表明,不同科的植物种子富Met贮藏蛋白基因存在较大差异,禾本科植物则较为保守,尤其是稻属中富Met贮藏蛋白基因高度保守,玉米中则存在不同类型的富Met贮藏蛋白。本研究丰富了富Met贮藏蛋白基因库,为豆科植物富Met基因工程提供了更多选择,为进一步理解富Met贮藏蛋白在植物发育代谢中的作用机理提供了参考。     

红花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达分析

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶。为了探究SAMS在红花逆境胁迫方面的作用,本研究根据红花转录组数据从红花品种豫红花1号克隆得到1个SAMS的全长cDNA序列,命名为CtSAMS1,并对其进行生物信息学分析、组织表达特性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析。结果表明,红花CtSAMS1基因的开放阅读框(ORF)长1 173 bp,编码390个氨基酸,其蛋白分子质量为42.7 kDa,蛋白保守区预测表明CtSAMS1具有甲硫氨酸腺苷转移酶的保守结构域,属于S-腺苷甲硫氨酸合成酶家族。系统进化分析显示CtSAMS1与来自菊科的SAMS亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明,CtSAMS1基因在花和茎中表达量最高,在其他组织部位中表达量极低;CtSAMS1基因表达量随着花瓣衰老程度的增加而升高。盐、干旱和低温胁迫均能够诱导CtSAMS1基因的表达,茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸能够诱导红花花瓣中CtSAMS1基因表达,赤霉素对CtSAMS1基因表达有一定的抑制作用。本研究为进一步研究CtSAMS1在红花中的抗逆机制,以及为培育红花抗逆新品种奠定了理论基础。     

鸡β-防御素基因的克隆与结构分析

通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。