三疣梭子蟹呼吸器管的组织学研究

三疣梭子蟹（Ｐｏｒｔｕｎｕｓｔｒｉｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）的呼吸器官主要是鳃,两侧对称排列,每侧八枚,除第二枚关节鳃的鳃轴在一侧外,其余几枚的组织结构均相似,最外层为薄层角质膜,其深层为单层上皮。从鳃的横切面观察,背面血管为入鳃血管,腹面的为出鳃血管,连接这两条血管的结缔组织为鳃轴。鳃轴向两侧（或一侧）生出数条鳃丝。鳃丝主要由在细胞和上皮细胞构成,扫描电镜观察发现,入鳃血管的侧壁上有成列的卵圆形孔,这些孔与鳃丝相通。采用汞溴酚蓝等４种方法,对上述几种结构分别进行了组织化学研究。     

壳寡糖对三疣梭子蟹免疫力的影响

为研究壳寡糖对三疣梭子蟹免疫功能的影响,设置了含壳寡糖0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/kg（分别为T0、T1、T2、T3和T4组）的5组试验饲料饲喂三疣梭子蟹,分别在第10 d、20 d和30 d取血清进行酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LSZ）和过氧化物酶（POD）活性的测定,试验结束时测定血细胞的密度。结果显示,在基础饲料中添加适量的壳寡糖可以显著性提高ACP、T-SOD、LSZ、POD活力（P〈0.05）,对PO和AKP活力促进效果不显著（P〉0.05）。壳寡糖可以显著提高三疣梭子蟹血细胞密度（P〈0.05）,对3种血细胞所占比例有一定的影响（P〉0.05）。综合考虑,T2、T3组对三疣梭子蟹免疫促进效果较好,建议基础饲料中壳寡糖添加量为1.0～1.5 g/kg。     

CuO-ENPs对三疣梭子蟹的急性毒性研究

采用半静水法,研究了Cu O-ENPs对三疣梭子蟹的急性毒性作用。结果表明:在海水p H值=7.9~8.2、T=24.0~25.2℃、S=27.9~29.1的条件下,Cu O-ENPs对三疣梭子蟹的96 h LC50为49 mg/L,95%置信区间为37~60 mg/L,Cu O-ENPs对三疣梭子蟹的安全浓度为0.49 mg/L。Cu O-ENPs对三疣梭子蟹的毒为低毒。     

不同地理群体三疣梭子蟹非特异性免疫功能的比较

测定了海州湾、辽东湾、舟山沿海和莱州湾4个野生群体三疣梭子蟹(Porttmus tritubercalatus)的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织中的抗氧化及其它与非特异性免疫相关的酶活指标,并对这些指标在不同群体间的差异进行了比较.结果发现:海州湾群体的三疣梭子蟹肝胰腺SOD酶活显著高于莱州湾群体(P<0.05).而与其它两个群体差异不显著;而血淋巴和肌肉组织SOD酶活各个群体间差异均不显著(P>0.05).海州湾群体血淋巴和肝胰腺组织GSH-px酶活显著高于莱州湾群体(P<0.05),而与其它群体差异不显著(P>0.05).不同地理群体三疣梭子蟹各体组织中MDA含量、LSZ和ALP酶活均没有显著性差异(P>0.05).笔者全面比较了4个地理群体三疣梭子蟹免疫相关酶活指标的差异,揭示了不同地理群体三疣梭子蟹免疫、抗病能力差异的内在因素.     

四氯乙烯对黄姑鱼幼鱼和三疣梭子蟹的急性毒性

采用半静水法,研究了四氯乙烯对黄姑鱼幼鱼和三疣梭子蟹的急性毒性作用。结果表明,在海水pH=7.85～8.04、T=24.4～25.5℃、S=25.9～27.3条件下,四氯乙烯对黄姑鱼幼鱼和三疣梭子蟹的96 h LC50分别为38 mg/L和64 mg/L,95%置信区间分别为28～68 mg/L和44～78 mg/L。四氯乙烯对黄姑鱼幼鱼和三疣梭子蟹的安全浓度分别为0.38 mg/L和0.64 mg/L。四氯乙烯对三疣梭子蟹和黄姑鱼幼鱼的毒性均为低毒。     

水流对三疣梭子蟹幼蟹运动行为和代谢的影响

在实验室条件下,观察了水流刺激对不同体重（小、中、大3种规格的体重分别为13．348g±1．751g、21．71g±1．247g、30．308g±3．009g）的三疣梭子蟹Portunus trituberculatus幼蟹运动行为的影响,研究了幼蟹在水流刺激（23cm／s）1h及恢复12、24h时的耗氧率、氨氮排泄率、氧氮比和血蓝蛋白含量的变化。结果表明：小、中、大3种规格幼蟹最大耐流流速分别为23．0、26．7、31．0cm／s,水流刺激对幼蟹的运动行为影响显著。当流速为23．0cm／s时,3种规格的幼蟹均在水槽底部顶流爬动;流速高于23cm／s时,小规格组幼蟹趴于拦网区不动。幼蟹的耗氧率和氨氮排泄率随体重增大而降低,在水流刺激1h后,3种规格幼蟹的耗氧率、氨氮排泄率和血蓝蛋白含量均下降,而氧氮比升高;静水中恢复12h,其氧氮比恢复至正常,耗氧率、氨氮排泄率和血蓝蛋白含量升高,至24h恢复到正常水平;与对照组相比,水流刺激1h后和恢复12h时幼蟹的耗氧率、氨氮排泄率差异显著（P〈0．05）,恢复24h后无显著差异（P〉0．05）。     

水流对三疣梭子蟹幼蟹运动行为和代谢的影响

在实验室条件下,观察了水流刺激对不同体重(小、中、大3种规格的体重分别为13.348 g±1.751 g、21.71 g±1.247 g、30.308 g±3.009 g)的三疣梭子蟹Portunus trituberculatus幼蟹运动行为的影响,研究了幼蟹在水流刺激(23 cm/s)1 h及恢复12、24 h时的耗氧率、氨氮排泄率、氧氮比和血蓝蛋白含量的变化。结果表明:小、中、大3种规格幼蟹最大耐流流速分别为23.0、26.7、31.0 cm/s,水流刺激对幼蟹的运动行为影响显著。当流速为23.0 cm/s时,3种规格的幼蟹均在水槽底部顶流爬动;流速高于23 cm/s时,小规格组幼蟹趴于拦网区不动。幼蟹的耗氧率和氨氮排泄率随体重增大而降低,在水流刺激1 h后,3种规格幼蟹的耗氧率、氨氮排泄率和血蓝蛋白含量均下降,而氧氮比升高;静水中恢复12 h,其氧氮比恢复至正常,耗氧率、氨氮排泄率和血蓝蛋白含量升高,至24 h恢复到正常水平;与对照组相比,水流刺激1 h后和恢复12 h时幼蟹的耗氧率、氨氮排泄率差异显著(P<0.05),恢复24 h后无显著差异(P>0.05)。     

三疣梭子蟹血清凝集素的生物学特性

对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血清凝集素的凝集特性进行了研究。结果表明:三疣梭子蟹血清凝集素对鲫鱼、中华鳖、草鱼、鸡和人类A、B、O型血细胞没有凝集作用,但是对小鼠、兔的血细胞表现出较强的凝集活性,其中对小鼠血细胞的血凝活性达到210,对兔血细胞的血凝活性达到28;盐度对其凝集活性有较大影响,Na Cl浓度在0.6 mol/L以上时基本失活;凝集素活性最适p H值为6.0~7.4;血清凝集素对Ca2+、Mg2+离子有明显的依赖性,EDTA可以明显抑制其凝集活性;糖抑制结果表明,血清凝集素活性能被N-乙酰葡萄糖胺及N-乙酰甘露糖胺特异性抑制;对血清凝集素进行硫酸铵分级沉淀分离后,发现凝集素活性主要分布在25%饱和度硫酸铵沉淀区;聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,主要蛋白条带在72~95 ku。     

三疣梭子蟹血清凝集素的生物学特性

对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血清凝集素的凝集特性进行了研究.结果表明:三疣梭子蟹血清凝集素对鲫鱼、中华鳖、草鱼、鸡和人类A、B、0型血细胞没有凝集作用,但是对小鼠、兔的血细胞表现出较强的凝集活性,其中对小鼠血细胞的血凝活性达到210,对兔血细胞的血凝活性达到28;盐度对其凝集活性有较大影响,NaCl浓度在0.6 mol/L以上时基本失活;凝集素活性最适pH值为6.0～7.4;血清凝集素对Ca2+、Mg2+离子有明显的依赖性,EDTA可以明显抑制其凝集活性;糖抑制结果表明,血清凝集素活性能被N-乙酰葡萄糖胺及N-乙酰甘露糖胺特异性抑制;对血清凝集素进行硫酸铵分级沉淀分离后,发现凝集素活性主要分布在25％饱和度硫酸铵沉淀区;聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,主要蛋白条带在72～95 ku.     

三疣梭子蟹雌雄个体遗传差异的SRAP分析

应用三疣梭子蟹SRAP-PCR优化体系,从88个SRAP引物组合中筛选出17个组合对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌、雄个体遗传差异进行分析,共获得146个位点,雌性个体获得139个位点,多态位点比例为69.78;雄性个体检测到129个位点,多态位点比例达79.07。雌性和雄性的Nei''s基因多样性分别为0.2315和0.2682,Shannon''s信息指数为0.3478和0.4026,雌雄个体间的相似系数为0.5959~0.8417,遗传距离为0.1583~0.4041。用TFPGA软件绘制了个体间的聚类图。另外在5个SRAP选择扩增组合中发现了6个位点在雌雄个体间扩增差异较大,其中4个位点显性条带个体为雄性的比例为12.5%~20%;2个位点显性条带个体为雌性的比例为100%。     

三疣梭子蟹微卫星文库的构建及序列分析

采用磁珠富集法筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星序列。经Sau3AI酶切后的200~1000bp DNA纯化片段,与两端已知序列的人工接头连接,用含有生物素标记的(CA)₁₂和(GA)₁₂探针杂交,根据磁珠的链酶亲和素与生物素特异结合的特性,捕获含微卫星序列的单链DNA,以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,随后将获得的片段连接到PMD18-T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,成功构建了微卫星富集文库。测序其中的60个阳性克隆,得到42条微卫星序列(基因登录号为:HQ283153-HQ283194),除探针使用的CA/GT、GA/CT重复外,还得到GAGT重复序列。42条微卫星序列中,完美型31个(占73.8%),非完美型9个(占21.4%),混合型2个(占4.8%)。完美型的比例显著高于非完美型,这与其他真核生物微卫星序列的特征相一致。39条微卫星序列的重复次数大于10(占92.9%),其中,重复次数在10~19次之间的有27个,20次以上的有12个。筛选出的微卫星位点可为今后三疣梭子蟹遗传多样性评价、种群遗传结构鉴定及资源保护研究提供一套有用的分子标记。     

三疣梭子蟹雌激素相关受体基因在蜕皮过程中的表达分析

雌激素相关受体(ERR)在甲壳动物蜕皮过程中可能起着重要的调节作用,但是尚不清楚该基因在三疣梭子蟹不同组织和不同蜕皮阶段的表达模式。本文采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了三疣梭子蟹雌激素相关受体(Pt ERR)基因在不同组织和不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明,Pt ERR-mRNA在C期三疣梭子蟹的Y器官和鳃中表达水平最高,其次眼柄和胃中表达水平也相对较高,在3种肌肉组织和三角膜中表达水平较低。在不同蜕皮阶段,13种组织中的Pt ERR-mRNA表达水平均差异显著。Y器官中Pt ERR-mRNA从AB期到E期呈显著上升趋势;胸神经节和眼柄中的Pt ERR-mRNA变化模式均为先上升后下降趋势,大颚器中的Pt ERR-mRNA变化趋势为先下降后上升;大螯肌肉、附肢肌肉和三角膜中的Pt ERR-mRNA表达水平均呈显著升高趋势,而腹部肌肉中Pt ERR-mRNA为先下降后上升趋势;就消化代谢器官而言,胃、肝胰腺和鳃中Pt ERR-mRNA在整个蜕皮周期中均为先升高后降低的趋势,其中D期达最高值;肠道中Pt ERR-mRNA相对表达量在D期最高,C期和E期较低;从AB期至E期,心脏中Pt ERR-mRNA表达水平一直显著增加,每期增加1倍左右。综上,Pt ERR主要在Y器官、鳃、眼柄和胃中表达,可能参与调控蜕皮过程、细胞增殖和能量代谢等。     

水体Cu2+对三疣梭子蟹主要组织ROS含量和抗氧化能力的影响

为探究水体Cu2+对三疣梭子蟹主要组织氧自由基水平和抗氧化能力的影响,采用生态学单因子梯度试验方法,研究了不同浓度水体Cu2+(0.04、0.4、2、4 mg·L-1)胁迫下三疣梭子蟹鳃、肝胰腺、肌肉组织中的活性氧(ROS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果表明:与对照组相比,低浓度水体Cu2+(0.04、0.4 mg·L-1)对三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织ROS含量没有显著影响,而高浓度水体Cu2+(2、4 mg·L-1)会导致鳃、肝胰腺和肌肉组织ROS含量显著升高,且升高的幅度与Cu2+浓度成正比。低浓度水体Cu2+(0.04、0.4 mg·L-1)对三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织的SOD活性和T-AOC均具有诱导作用,随实验时间的延长,SOD活性和T-AOC呈峰值变化;而高浓度水体Cu2+(2、4 mg·L-1)短时间内对梭子蟹的鳃、肝胰腺、肌肉组织的SOD活性及鳃T-AOC具有诱导作用,但对肝胰腺和肌肉T-AOC却有明显的抑制作用,在实验时间内两种组织T-AOC始终低于对照组,并呈逐渐下降趋势。由此说明低于0.4 mg·L-1的水体Cu2+在三疣梭子蟹抗氧化解毒能力的可控范围,但高于2 mg·L-1的水体Cu2+会对三疣梭子蟹主要组织细胞造成损伤,使之抗氧化解毒能力下降。抗氧化酶和非酶抗氧化物在三疣梭子蟹抵御Cu2+胁迫中共同发挥作用,三种组织SOD和T-AOC表现出明显的时间和剂量效应。     

亮腹釉小蜂不同发育阶段的形态及寄生行为

【目的】研究柑橘木虱Diaphorina citri优势寄生蜂亮腹釉小蜂Tamarixia radiata的个体发育形态学及寄生行为,为柑橘黄龙病的生物防控提供理论和技术指导。【方法】在温度为(26±1)℃、相对湿度为60%~80%的试验条件下,观察亮腹釉小蜂寄生行为及个体发育形态,并测量形态学指标。【结果】亮腹釉小蜂寄生柑橘木虱3~5龄若虫产卵;亮腹釉小蜂整个发育历程分为卵、幼虫、蛹、成虫4个阶段;室内条件下其世代发育历期约为13.40 d;雌虫个体明显大于雄虫;雄虫触角刚毛发达,几乎覆盖整个触角基节,而雌虫触角刚毛很短,触角基节清晰可见;雌虫腹部背面黄色区域明显大于雄虫。【结论】亮腹釉小蜂为柑橘木虱体外寄生蜂,雌、雄成虫形态有显著差异。     

西瓜枯萎病菌和哈茨木霉的GFP标记及根部动态定殖比较

为明确西瓜枯萎病菌和生防哈茨木霉在西瓜根部动态定殖的差异,采用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化法,将携带绿色荧光蛋白基因的pCT74质粒分别与尖镰孢菌西瓜专化型和哈茨木霉M3菌株的基因组整合获得相应的转化子;将转化子接种于土壤,利用激光共聚焦显微镜示踪并比较两菌株转化子对西瓜幼苗根部的侵染动态过程。结果表明,转化子连续传代6次仍能发出绿色荧光且荧光强度稳定,能够稳定遗传,经PCR验证绿色荧光蛋白基因转入成功。盆栽试验中,两种转化子均能成功定殖于西瓜幼苗根部,在定殖初期,尖镰孢菌西瓜专化型在根内的扩散速度快于哈茨木霉M3菌株。     

茶树己糖激酶基因CsHXK1的克隆与表达分析

己糖激酶(HXK)是植物呼吸和代谢过程中的关键酶之一,不仅催化己糖磷酸化,而且参与植物糖感应和糖信号转导过程,在植物生长发育和逆境响应中发挥重要作用。试验以茶树‘龙井长叶’为材料,克隆获得了茶树己糖激酶基因 CsHXK1的cDNA序列,其包含一个1 488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸,预测蛋白分子质量为53.63 ku,理论等电点为5.96。蛋白序列分析结果显示,CsHXK1含有2个保守的磷酸化激酶域、1个底物结合域和1个ATP结合域,与拟南芥、苹果等HXK1亲缘关系较近。另外, CsHXK1基因启动子区域包含多种与逆境响应和糖信号转导相关的顺式作用元件,如ABA响应元件(ABRE)、脱水响应元件(MYBCORE)及糖信号转导相关元件(SREATMSD)等。qRT-PCR分析结果显示, CsHXK1基因表达受高温、干旱、低温及盐胁迫的诱导,其可能在茶树响应多种非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾与玉米粘虫肠道细菌比较

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)于2019年5月被发现已经入侵至重庆地区, 6月底在江津地区的高粱地中也发现了少量的草地贪夜蛾,同时还发现了大量玉米黏虫(Mythimna seperata).通过分离培养同一生境内的草地贪夜蛾和玉米黏虫的肠道细菌,结合16S rDNA测序完成了这两种害虫肠道优势菌属水平的鉴定,共分离得到了19个细菌分离株,其中分离自草地贪夜蛾肠道细菌归为5个属,分别为欧文氏菌属(Erwinia),不动杆菌属(Acinetobacter),肠杆菌属(Enterobacter),肠球菌属(Enterococcus),假单胞菌属(Pseudomonas).分离自玉米黏虫肠道细菌归为6个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella),不动杆菌属(Acinetobacter),寡养单胞菌属(Stenotrophomonas),肠球菌属(Enterococcus),金黄杆菌属(Chryseobacterium),芽孢杆菌属(Bacillus).同时我们也对采自玉米地和高粱地的草地贪夜蛾肠道微生物优势菌进行了比较分析,在江津高粱地中的草地贪夜蛾中没有发现克雷伯氏菌,但该菌在巫山、巫溪玉米地的草地贪夜蛾中大量存在.结论为进一步研究草地贪夜蛾幼虫肠道核心微生物群奠定了基础.     

花椒窄吉丁对寄主挥发物的触角电位及行为反应

【目的】探明寄主挥发物对花椒窄吉丁的引诱或驱避作用,为研制和开发花椒窄吉丁植物源引诱剂或驱避剂提供理论依据。【方法】利用固相微萃取和GC-MS分析花椒健康植株和受花椒窄吉丁危害植株不同部位的主要挥发性化合物,并采用触角电位仪(EAG)和Y型嗅觉仪测定花椒窄吉丁对寄主植物挥发物的触角电位和行为反应。【结果】健康花椒叶片中主要含β-石竹烯(13.27%)、反式β-罗勒烯(16.82%)和α-罗勒烯(16.42%),嫩枝中主要含β-石竹烯(25.98%)、乙酸香叶酯(15.89%)和荜澄茄油烯(17.27%),韧皮部主要含(1R)-(+)-α-蒎烯(25.91%)和β-石竹烯(47.98%)。花椒受虫害后各部位的月桂烯、(1R)-(+)-柠檬烯和乙酸芳樟酯的相对含量均升高,β-石竹烯和乙酸香叶酯相对含量均降低;韧皮部有新的挥发物α-水芹烯等生成。11种挥发物均能引起花椒窄吉丁的触角电位(EAG)反应,且多数挥发物在100μg/μL时引起成虫的EAG反应最强,但β-蒎烯在10μg/μL时引起两性成虫最大的EAG反应绝对值,(1R)-(+)-柠檬烯、月桂烯在10μg/μL时引起雌虫最大的EAG反应绝对值,在100μg/μL时引起雄虫最大的EAG反应绝对值。11种挥发物中乙酸香叶酯、桉叶油醇、葎草烯引起花椒窄吉丁的EAG反应相对较弱。除α-水芹烯,两性成虫对挥发物的EAG反应不存在显著的性别差异。行为反应测定结果表明,(1R)-(+)-α-蒎烯在1μg/μL时对雌雄成虫均有显著地驱避作用,β-蒎烯在0.1μg/μL时对雄虫有显著地驱避作用,β-石竹烯在10μg/μL时对雌虫有显著驱避作用(P0.05)。0.1μg/μL的水芹烯、10和100μg/μL月桂烯、0.1和1μg/μL(1R)-(+)-柠檬烯对雄虫具有明显的引诱作用。0.1~10μg/μL乙酸芳樟酯对雌虫具有引诱作用,在100μg/μL时却表现出驱避作用。【结论】花椒受虫害后各部位挥发物的种类和相对含量发生改变,其中月桂烯、(1R)-(+)-柠檬烯和乙酸芳樟酯的相对含量明显升高,β-石竹烯、乙酸香叶酯的相对含量明显降低,并有新物质α-水芹烯等生成。0.1μg/μLα-水芹烯、10~100μg/μL月桂烯、0.1~1μg/μL(1R)-(+)-柠檬烯、0.1~10μg/μL乙酸芳樟酯对花椒窄吉丁具有引诱作用,1~100μg/μL(1R)-(+)-α-蒎烯、0.1μg/μLβ-蒎烯、10μg/μLβ-石竹烯对花椒窄吉丁具有驱避作用。     

干酪乳杆菌对DSS诱导结肠炎小鼠焦虑样行为的影响及对结肠的保护作用

为研究干酪乳杆菌对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎小鼠焦虑样行为的影响及对结肠的保护作用,本研究分为对照组、DSS组、干酪乳杆菌组和干酪乳杆菌预防组,通过旷场试验比较各组小鼠行为学差异;统计并比较不同组小鼠体重、结肠长度、肠道上皮、炎性浸润、粪便潜血等的变化;HE染色法检测各组小鼠肠道结构的变化。结果显示:1)干酪乳杆菌预防组小鼠在旷场箱中活动的距离及在中央区域停留的时间显著增加(P<0.05);2)与DSS组相比,干酪乳杆菌预防组结肠长度、小鼠体重显著增加,组织学评分和疾病活跃指数显著降低(P<0.05),结肠肠道结构更加完整。综上,干酪乳杆菌可减轻小鼠焦虑样行为,缓解DSS对小鼠结肠的损伤,发挥对急性肠炎的保护作用。