油桐叶肉细胞原生质体分离及瞬时转化体系的建立

【目的】探索油桐叶肉细胞原生质体分离的最适条件,建立油桐原生质体的遗传转化体系,使在油桐体内研究自身基因的功能成为可能。【方法】以油桐成熟叶片和组培苗幼叶为材料,通过酶解法成功分离得到油桐叶肉细胞的原生质体并确定最适分离条件。在此基础上,以获得的原生质体为受体系统,建立PEG介导的油桐原生质体基因转化方法。【结果】原生质体分离结果表明,酶解时间对原生质体产量和活性的影响最大,其次是纤维素酶浓度,而离析酶浓度和甘露醇浓度对原生质体产量和活性的影响较小。以成熟叶片为材料分离原生质体的最适条件为纤维素酶浓度1.5%、离析酶浓度1%、甘露醇浓度0.6 mol·L-1、酶解时间12 h,以组培苗幼叶为材料分离原生质体的最适条件为纤维素酶浓度2%、离析酶浓度1%、甘露醇浓度0.7 mol·L-1、酶解时间6 h。为了建立油桐原生质体的瞬时转化体系,通过PEG介导法将拟南芥MGT6基因导入到油桐原生质体中,结果发现MGT6蛋白定位于原生质体质膜,与之前报道的研究结果一致,这表明本研究建立的油桐原生质体转化方法可成功将外源基因导入油桐原生质体并使其表达。【结论】建立油桐成熟叶片和组培苗幼叶叶肉细胞原生质体的高效分离方法,综合考虑取材的便利性和对后续原生质体培养的影响,建议以组培苗幼叶为材料分离原生质体,分离条件为纤维素酶浓度2%、离析酶浓度1%、甘露醇浓度0.7 mol·L-1、酶解时间6 h。在分离得到油桐叶肉细胞原生质体的基础上,本研究建立的PEG介导的原生质体遗传转化方法能以油桐叶肉细胞原生质体为受体,高效地将外源基因导入其中并使外源基因表达。本研究结果不仅可促进油桐基础研究的发展,在通过细胞融合和基因工程手段进行油桐种质创新方面也具有重要意义。     

地锦与五叶地锦原生质体分离及培养研究

用纤维素酶、果胶酶、甘露醇的混合酶液提取地锦和五叶地锦无菌苗幼叶、五叶地锦胚乳愈伤组织及地锦幼胚愈伤组织的原生质体,对影响原生质体提取得率及活力因素进行分析,对不同材料原生质体得率进行比较,对提取的原生质体进行液体浅层、固液结合及固体等方式培养,对原生质体形成的愈伤组织以MS和改良B5培养基附加不同浓度NAA、6-BA、2,4-D、PEG、KT、ZT等进行分化培养.试验结果表明纤维素酶对原生质体提取得率有极显著影响,适宜地锦幼叶原生质体提取的酶液组合为纤维素酶O.5%、果胶酶0.3%、甘露醇0.6 mol·L-1、酶解8 h;不同材料原生质体提取得率有显著差异;仅五叶地锦胚乳愈伤组织来源的原生质体在固体培养基中形成新的愈伤组织,其它方式培养的不同材料原生质体均无分裂或仅形成数十个细胞的细胞团后便解体;用30余组配方进行了五叶地锦胚乳愈伤组织原生质体形成的新愈伤组织的分化培养,继代6～10次后仍无分化迹象.     

不同酶解条件对金边瑞香幼叶原生质体分离的影响

以室内培养的金边瑞香浅黄绿色、质地幼嫩的叶片为材料,探讨了影响其原生质分离的因素。结果表明:对原生质分离效果影响最大的是纤维素酶浓度和酶解时间;采用纤维素酶质量分数为0.2%、甘露醇质量浓度为0.6 mol.L-1、酶解时间为10 h时原生质分离效果最好,原生质体的产量为2.2×105个.g-1。     

杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立

【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考。【方法】选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离。采用改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Li Cl+10μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果。【结果】在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3%BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2 h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94%。7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、改良CTAB-Li Cl法、改良CTAB-Li Cl+10μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好。【结论】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5%、离析酶R-10浓度1%、果胶酶Y-23浓度0.2%、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3%,真空处理10 min,酶解2 h,可大量获得高质量的杉木原生质体;利用改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法,可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg。研究结果为杉木重要性状关键基因的功能研究及其在育种中的应用提供了重要基础。     

人心果原生质体分离初探

以人心果幼嫩叶片组织为材料,研究了酶液组合、酶解时间、酶液中甘露醇含量、pH值、温度等因素对其原生质体分离的影响,结果表明:以3%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23为混合酶液,0.6 mol.L-1甘露醇为渗透压稳定剂,pH 5.6的酶液组合,在28℃的黑暗条件下振荡,酶解时间2 h,分离出的原生质体产量最佳,可达到12.4×106个.g-1。     

山地杨MD-110原生质体的分离技术

山地杨MD-110(P.maximowiczii×P.deltoides)是黑杨派与青杨派的优良杂交品种.选择生长约1个月无菌苗的健壮叶片(长1.5～2 cm),切成长约0.5 mm的细条,在2%纤维素酶RS、0.05%果胶酶Y-23、0.6 M甘露醇(pH=5.6)组成的酶液进行分离,分离出大量的具有活力的原生质体,且大小均匀,细胞膜完整;酶解2 h后轻轻摇动培养皿利于酶解,酶解时间以6 h为宜.纯化后其原生质体的产量为3.6×107/gfr.wt,活力可达90%以上.纯化后的原生质体在B5(2倍浓度)培养基,附加2,4-D 10 nag·L-1、NAA 0.2 mg·L-1和BAP 1 mg·L-1中进行高密度液体浅层培养.     

转基因741杨原生质体游离与纯化研究

以转双抗虫基因741杨无菌苗叶片为材料,对叶片原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了分析研究.结果表明,上部叶片产量和活力均高于其他叶位,在实验的浓度范围之内,Macerozyme R-10(离析酶)、Cellulase Onozuka R-10(纤维素酶)、Driselase (Sigma)(崩溃酶)对原生质体的产量和活力无显著影响.适宜转双抗虫基因741杨叶片原生质体游离与纯化的条件为无菌苗上部叶片为材料,0.7 mol/L甘露醇的CPW盐溶液预质壁分离1～1.5 h CPW+0.5％ Macerozyme R-10+0.25％ CellulaseOnozuka R-10+0.025％ Driselase (Sigma)+ 0.5 mol/L甘露醇(pH 5.7),酶解温度27℃,酶解时间10 h,用“过滤-离心-漂浮法”纯化原生质体.     

狭叶薰衣草愈伤组织诱导及原生质体分离研究

探究薰衣草愈伤组织诱导及原生质体分离的最适条件,为薰衣草品种优化和育种工作提供基础数据和理论依据。以薰衣草幼嫩叶片为原材料,采用化学诱导方法诱导薰衣草脱分化形成愈伤组织,利用酶解法促使原生质体游离;结合染色排除法计算原生质体活力。实验结果表明,当MS培养基中加入2,4-D(1.8mg/L)和6-BA(0.5mg/L)时,薰衣草的出愈率最高,可达88%;愈伤组织在纤维素酶和果胶酶的含量分别为1.8%、0.5%的条件下,酶解原生质体的产量最高,可达1.180×10~5个/g,原生质体活力最高,可达78.05%。本实验获得的高效愈伤组织诱导条件,为后续愈伤组织再生体系研究提供资料支持。建立了原生质体分离体系,稳定的获得了高产量、高活力的原生质体。     

纤维素酶在玉米芯上的吸附及其水解作用

对纤维素酶在玉米芯纤维底物上的吸附特征及其水解作用进行了研究.纤维素酶组分中的外切型β-葡聚糖酶(C1酶) 、内切型β-葡聚糖酶(CMC酶)和纤维二糖酶(CB酶)在同一纤维素底物上具有不同的吸附性质,底物的粒度、预处理条件、pH值、温度等因素对纤维素酶的吸附具有不同的影响.在特定的酶解条件下(底物质量分数10 %,pH值4.8,50 ℃),C1酶、CMC酶组分主要吸附在玉米芯纤维底物上,而CB酶组分则大部分游离在液相中.利用纤维素酶的吸附特性,在玉米芯酶解工艺中实现了纤维素酶的回收复用.当玉米芯纤维底物质量分数为10 %,纤维素酶初始用量为每克底物15 FPIU ,酶解48 h后滤去水解液,保留纤维素残渣并加入新鲜底物,同时补加纤维二糖酶(每克底物4 IU)和少量纤维素酶(每克底物7.5 FPIU),继续酶解48 h,如此重复进行.连续重复7批的试验结果表明:这一酶解工艺简便易行,纤维素酶的用量可节约50 %, 同时纤维素的酶解得率平均可达80 %以上.这一研究结果在可再生纤维素资源酶法糖化利用方面具有重要意义.     

银杏原生质体制备及其融合研究

以银杏品种湖南梅核成熟胚进行组织培养得到的无菌苗和愈伤组织为材料,用不同酶液处理进行原生质体制备,并用PEG法进行原生质体融合实验。结果显示,以2.0%纤维素酶+1.0%果胶酶+5.0mmol/LMES+6mmol/LCacl2+0.6mol/L甘露醇( 号酶液)酶解银杏组织、方法1提取原生质体效果最好,其最高原生质体产率为9.4×107个/g;以17%蔗糖溶液处理得到原生质体质量最好。用40%PEG6000+0.3mol/L钙离子+pH9.5液体处理原生质混合液,银杏原生质体融合率最高,为67%。     

<Emphasis Type="Italic">Nitraria sibirica</Emphasis> cell suspension culture: establishment,characterization and application

Nitraria sibirica Pall. is a shrub that grows in saline-alkali soil and has traditional medicinal value and potential commercial value. The objectives of this study include induction and multiplication of callus, establishment of a suspension cell line, and isolation of protoplasts from cell suspensions. Murashige and Skoog (MS) medium was used for callus induction from mature seeds of N. sibirica. Seed-derived calluses were further multiplied on MS medium augmented with 0.5 mg L^?1 6-benzylaminopurine (6-BA) and 1.0 mg L^?1 2,4-dichlorophenoxy (2,4-D) acetic acid. Suspension cultures of N. sibirica were initiated by transferring friable calli to the same liquid multiplication medium. Characterization of the suspension culture was assessed based on fresh mass, dry mass, cell viability and pH value of the culture. A typical growth curve was observed after inoculating 1.5 g of callus in 40 mL liquid medium, including a lag phase, an exponential growth phase, a stationary phase, and a negative acceleration phase. The effect of factors such as pre-plasmolysis, enzyme combination, enzymolysis time and mannitol concentration, on the isolation of cell-derived protoplasts were evaluated to determine the usefulness of suspension cultures. The maximum yield (9.79 × 10⁶ cells/g) and highest viability (79.97%) of protoplast were reached when approximately 1 g of cell suspension (cultured for 6 days) was inoculated for 12 h in cell and protoplast washing solution made of 0.8 mol L^?1 mannitol mixture solution, cellulose onozuka R-10 2% (w/v), hemicellulose 0.2%, macerozyme R-10 1%, and pectolyase Y-23 0.5%. Protoplast yield was significantly influenced by pre-plasmolysis and cellulose onozuka R-10 (P < 0.05).     

Nitraria sibirica cell suspension culture:establishment,characterization and application

Nitraria sibirica Pall.is a shrub that grows in saline-alkali soil and has traditional medicinal value and potential commercial value.The objectives of this study include induction and multiplication of callus,establishment of a suspension cell line,and isolation of protoplasts from cell suspensions.Murashige and Skoog(MS) medium was used for callus induction from mature seeds of N.sibirica.Seed-derived calluses were further multiplied on MS medium augmented with 0.5 mgL~(-1) 6-benzylaminopurine(6-BA) and 1.0 mgL~(-1) 2,4-dichlorophenoxy(2,4-D) acetic acid.Suspension cultures of N.sibirica were initiated by transferring friable calli to the same liquid multiplication medium.Characterization of the suspension culture was assessed based on fresh mass,dry mass,cell viability and p H value of the culture.A typical growth curve was observed after inoculating 1.5 g of callus in 40 mL liquid medium,including a lag phase,an exponential growth phase,a stationary phase,and a negative acceleration phase.The effect of factors such as pre-plasmolysis,enzyme combination,enzymolysis time and mannitol concentration,on the isolation of cell-derived protoplasts were evaluated to determine the usefulness of suspension cultures.The maximum yield(9.79 9 106 cells/g) and highest viability(79.97%) of protoplast were reached when approximately 1 g of cell suspension(cultured for 6 days) was inoculated for 12 h in cell and protoplast washing solution made of 0.8 molL~(-1) mannitol mixture solution,cellulose onozuka R-10 2%(w/v),hemicellulose 0.2%,macerozyme R-10 1%,and pectolyase Y-23 0.5%.Protoplast yield was significantly influenced by pre-plasmolysis and cellulose onozuka R-10(P0.05).     

Isolation of protoplast from callus of Populus euphratica and H fluxes across plasma membrane under NaCl stress

We used callus of Populus euphratica Olive to isolate protoplasts, and H fluxes across plasma membrane were investi-gated. The concentration of enzymes for protoplast isolation, e.g. cellulase, pectolyase, macerozyme, hemicellulase, and sorbitol content, incubation time were systemically studied. High yield and viability of protoplast was achieved after 6-8 hours incubation of P. euphratica callus in enzyme solution containing 1.5% (w:v) cellulase R-10, 0.1% (w:v) pectolyase Y-23, 0.2% (w:v) macerozyme R-10, 0.05% (w:v) hemicellulase and 0.75-0.80 mol·L-1 sorbitol. Non-invasively ion selective microelectrode technique was used to access proton fluxes in the absence and presence of NaCl (20 mmol·L-1). Salt-induced transient net H efflux was observed in the plasma membrane of P. euphratica cells. The shift of H flux response to NaCl shock and the relevance to salt tolerance were discussed.     

转Bt基因健杨R-94对膜肩网蝽和2种潜叶蛾的抗性

杨树是我国北方的主要用材树种,不仅速生丰产,而且树冠高大,是优良的园林绿化和生态环境保护树种。近些年出于造纸业的需求,杨树在湖南、湖北等地也有大规模的种植。不过由于食叶和蛀干害虫的严重危害,杨树的大规模发展受到了一定的制约。1992年中国林业科学研究院林业研究所和     

双灭活原生质体融合构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株研究

以嗜鞣管囊酵母P - 01(Pachusolen tannophilus)和南阳酒精酵母1308(Saccharomyces cerevi-siae)的单倍体D - 12为亲本,通过双灭活原生质体融合技术,获得一株能够进行全糖发酵的稳定的酵母融合株F10,发酵醪液乙醇体积分数达到1.3%,比亲株P - 01的0.95%提高了36.8%.对玉米秸秆水解液进行发酵表明,融合株F10发酵玉米秸秆时乙醇体积分数最高可达1.1%,远高于亲株.     

桉树组织培养研究进展

桉树组织培养在理论和实践中都具有非常重要的意义。迄今为止,全世界约有60种桉树进行过组织培养技术研究,包括胚培养、芽培养及嫩茎培养、花药培养、悬浮培养、原生质体培养、体细胞胚培养等技术,绝大部分成功获得完整植株。