BHK21细胞冻存密度与复苏后活力的关系分析

对BHK21细胞不同的冻存密度与细胞复苏后活力的关系进行了统计分析.首先取处于对数生长期的细胞,以4种不同的密度进行冻存.这4种密度分布在0.5×107～4.0×107个/mL之间.冻存2周后,每种密度各复苏3支,计算其活力,分析密度与活力之间是否存在相关性.如此,平行做2次.结果发现,不同的细胞冻存密度与细胞复苏后的活力之间有相关性.     

ST细胞冷冻密度对复苏的影响

对ST细胞不同的冻存密度与细胞复苏后活力的关系进行了分析。首先取处于对数生长期的细胞,以4种不同的密度进行冻存,冻存2周后,每种密度各复苏3支,测定其活力。分析密度与活力之间是否存在相关性。如此,平行做3次。结果发现,不同的细胞冻存密度与细胞复苏后的活力之间有相关性。     

细胞的简易冻存技术与冻存液的选择

在组织培养和细胞杂交工作中,培养细胞的保种十分重要。目前保存细胞的唯一途径是液氮冻存。我们试用简易冷冻技术和不同的冻存液,对数种细胞株/系进行了冻存、复苏试验,现报告如下。     

鸵鸟种质资源保存中的体细胞培养

本研究利用皮肤植块法建立了鸵鸟胚胎成纤维细胞 ,并进行了传代、冻存、复苏和染色体核型分析实验。传代实验和染色体核型分析实验表明 ,鸵鸟胚胎成纤维细胞系可在体外存活 7～ 8代 ,且保持核型正常 ,而且 ,细胞冻存和复苏对核型也没有显著影响 ,从而证明利用体外培养的体细胞是进行保种可行的。     

蛋鸡骨骼肌卫星细胞分离培养及鉴定

采用组织块分离法从蛋鸡鸡胚腿部肌肉组织中体外培养获取鸡骨骼肌卫星细胞,对培养的细胞进行了传代、冻存和复苏研究,同时从分子表达水平对分离培养的卫星细胞进行了鉴定,建立了一套鸡骨骼肌卫星细胞分离、传代、冻存和复苏的方法。特异基因表达鉴定结果表明,该方法分离得到的细胞能够表达卫星细胞特异的标志基因Pax7,而肌细胞分化基因MyoD、Myogenin未表达,说明获得的肌卫星细胞纯度较高,尚未进行肌细胞的分化。     

甘油、DMSO细胞冻存液冻存效果的比较实验研究

目的采用两种不同的细胞冻存液对Vero细胞的冻存效果进行研究。方法本实验主要研究甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂,以及他们与血清、基础培养基的不同配比与细胞冻存效果之间的关系。结果发现不同的细胞冻存液在一定的所占比例内与细胞复苏后的成活率有一定的相关性,即在一定比例的冷冻剂保护下,细胞冻存的效果才会达到最佳。结论保护剂,无论是DMSO,还是甘油,其比例只有在10%-15%之间,细胞复苏后的成活率才达到最佳状态,即有利于细胞的冻存。且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。     

犊牛前脂肪细胞的传代培养

利用新生犊牛大网膜的脂肪组织原代培养脂肪细胞,待细胞贴满培养平皿底部90%时,进行细胞传代。观察细胞的形态;绘制细胞生长曲线、脂肪含量变化曲线;对细胞进行冻存与复苏,并计算复苏后的存活率。结果显示,细胞传代培养后,仍保持脂肪细胞蓄积脂肪的特性,细胞生长曲线与原代脂肪细胞的生长曲线依然一致,细胞冻存复苏后保持87%的存活率。     

猪呼吸道上皮细胞的体外原代培养研究

为探索猪呼吸道上皮细胞体外的原代培养,对胶原酶Ⅳ+胰酶消化法、胰酶消化法、胶原酶Ⅳ和胰酶消化结合组织块培养法以及组织块培养法等4种分离细胞的方法进行了比较,同时比较了不同浓度胎牛血清的培养基所培养细胞的纯度及成活率,采用差速贴壁法纯化细胞并对所得的上皮细胞进行冻存复苏研究。结果表明:组织块培养法培养获得的细胞数量和纯度极显著高于胰酶消化法(P0.01),胶原酶Ⅳ+胰酶消化法获得的细胞成活率显著高于胰酶消化法;含有5%血清的培养基培养的细胞成活率及纯度均高于用10%血清培养(P0.01),冻存1个月后的细胞复苏率为85%。     

番鸭胚成纤维细胞的原代分离与培养研究

为建立番鸭胚成纤维细胞(MDEF)的体外培养、传代和冻存技术,选用11胚龄番鸭胚,2.5g/L胰蛋白酶消化,原代MDEF于含100 mL/L血清的DMED培养液中培养;研究热、冷两种消化方法对MDEF消化密度及活率的影响,探讨不同血清浓度对MDEF生长、冻存活性的影响,以及离心对MDEF传代和复苏时细胞活率的影响。结果显示,胰酶消化法获得了MDEF,细胞贴壁紧密,生长良好;冷消化得到的原代MDEF密度和活率均高于热消化;血清浓度在20mL/L~100mL/L范围内,浓度越高MDEF生长速度越快;血清浓度显著影响MDEF复苏的活率;MDEF冻存液中DMSO∶血清∶培养液比例为1∶2∶7冻存效果良好;在MDEF传代和复苏过程中去除离心操作,不仅可简化操作,细胞活率也有一定提高。本研究建立了MDEF的原代分离和培养方法,为适用于番鸭相关研究的体外细胞培养体系奠定基础。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法.采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为l×106个/mL.采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复.液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察.结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异(P＜0.01),处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异(P＞0.05),处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异(P＜0.01)；处理4组的贴壁率高于处理2、5、6组,存在极显著差异(P＜0.01).形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其他组生长状态良好.因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法.     

梅花鹿鹿茸间充质层细胞的体外培养和冷冻保存

为了研究梅花鹿鹿茸间充质层细胞的生物学特性,取梅花鹿鹿茸生长顶端间充质层组织,分离间充质层细胞进行体外培养及冷冻保存。结果表明:在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,鹿茸间充质层细胞能进行短期体外培养,培养的细胞呈成纤维细胞样,培养7 d可长至汇合。以含5%二甲基亚砜(DMSO)和10%FBS的DMEM为冻存液,经梯度降温后冻存,间充质层细胞复苏后存活率较高。在4℃条件下,间充质层组织在含10%FBS的DMEM中可保存7 d。     

猕猴核移植研究进展及前景(续完)

3.5 卵母细胞、胚胎和体细胞的冻存超低温冷冻是体外保存体细胞、卵母细胞和胚胎的主要方法.体细胞冻存技术相对简单且复苏后具有较高的存活率,已有用体细胞冻存复苏后进行核移植产生存活哺乳动物的先例[24],猕猴核移植研究时,将经过短期传代的正常二倍体体细胞进行冻存,是解决供体细胞来源的可行方法之一.     

成年小鼠生精小管及睾丸的冷冻保存

采用含不同浓度抗冻剂二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)及丙三醇(G)的DMEM培养基作为冻存液,对成年小鼠生精小管及完整睾丸进行慢速冷冻,液氮保存,37 ℃水浴复苏,并测定细胞复苏率。结果表明,成年小鼠生精小管在50 mL/L、100 mL/L 及150 mL/L DMSO冻存液中的细胞复苏率分别为92.6%、93.4%及69.4%,在50 mL/L、100 mL/L及150 mL/L PG 冻存液中的细胞复苏率分别为94.2%,93.3%及66. 9%,在50 mL/L、100 mL/L 及150mL/L EG 冻存液中的细胞复苏率分别为87.2%、91. 0%及62. 6%,在50 mL/L、100mL/L及150 mL/L G冻存液中的细胞复苏率分别为90.0%、90.5%及67.1%。各种抗冻剂的最高细胞复苏率之间差异不显著(P> 0. 05 )。成鼠完整睾丸在含100 mL/LDMSO、PG、EG或G的冻存液中的细胞复苏率分别为56.0%、50.0%、50.2%及50.2%。结果显示,DMSO、PG、EG 及G 均适宜用作成年小鼠生精小管的抗冻剂,最佳使用浓度均为50 mL/L~100 mL/L。完整睾丸冷冻后的细胞复苏率低于60%,仍需进一步研究。     

太行青山羊附睾头细胞系的建立

试验旨在获得太行青山羊附睾头细胞体外培养体系,为附睾特异表达蛋白功能研究提供材料。对15日龄太行青山羊进行无菌去势获得附睾头组织,剪碎组织后,通过胰蛋白酶和胶原酶I消化水解,经过原代培养、传代培养、细胞冻存和复苏对细胞状态进行初步鉴定,另外绘制了生长曲线并分析了染色体数目。结果表明:原代培养、传代培养、冻存复苏后细胞状态良好,2~3 d能够达到90%融合度,且细胞生长趋势整体呈"S"型,染色体数目为2n=60,数目正常。该研究成功建立了太行青山羊附睾头细胞系。     

不同冻存保护剂对绵羊前体脂肪细胞冻存效果的影响

<正>【目的】探讨绵羊前体脂肪细胞冷冻保存的最佳冻存保护剂种类和浓度。【方法】在含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中分别添加不同浓度的DMSO、EG、PG、G和PVP作为冻存液,对原代培养的绵羊前体脂肪细胞进行冷冻保存后,检测复苏细胞存活率、细胞增殖能力、细胞中脂肪沉积量,测量GPDH活性,并用实时荧光定量PCR检测PPARγ和LPL mRNA的表达水平,最后对复苏细胞进行染色体核型分析。【结果】各种冻存保护液中,10%DMSO和5%DMSO+5%PVP     

敖汉细毛羊毛囊细胞系的建立及鉴定

为了研究敖汉细毛羊毛囊细胞的培养方法,建立敖汉细毛羊毛囊细胞系,保存毛囊细胞便于后续细胞水平毛囊相关基因的深入研究,试验采用胰蛋白酶消化法对初生40日龄以内的敖汉细毛羊皮肤组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存、复苏等方式成功分离并纯化出敖汉细毛羊毛囊细胞,然后对细胞进行了形态学观察,冻存、复苏活力检测,生长动力学分析,核型分析和微生物污染检测等分析。结果表明:原代毛囊细胞经胰蛋白酶消化及差速离心分离培养出毛囊细胞,冻存前细胞活力为94.19%,冻存1个月复苏后细胞活力为91.96%。细胞生长呈S型,经历潜伏期、指数生长期和平台期三个阶段。细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。试验成功分离了敖汉细毛羊毛囊细胞并建立了敖汉细毛羊毛囊细胞系。     

金华猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

试验以金华猪耳缘皮肤组织为材料,采用组织块贴壁法进行耳缘组织分离、培养、传代,并进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制等生物学特性研究。结果表明:金华猪耳缘组织成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后存活率分别为95.6%和93.8%;生长曲线呈"s"型。通过试验建立了稳定的金华猪耳缘组织成纤维细胞培养方法,说明组织块贴壁方法是获得成纤维细胞的简单有效方法,获得的细胞可在体外至少传代10代以上,能为体细胞克隆、转基因和异种器官移植等相关研究提供核细胞来源。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为1×106个/mL。采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复。液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察。结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异（P〈0.01）,处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异（P〉0.05）,处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异（P〈0.01）;处理4组的贴壁率高于处理2、5、6组,存在极显著差异（P〈0.01）。形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其他组生长状态良好。因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为1×106个/mL。采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复。液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察。结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异(P<0.01),处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异(P>0.05),处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异(P<0.01);处理4组的贴壁率高于处理2、5、6组,存在极显著差异(P<0.01)。形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其他组生长状态良好。因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

本试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为1×106个/mL。采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复。液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察。结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异(P0.01),处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异(P0.05),处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异(P0.01);处理4组的贴比率高于处理2、5、6组,存在极显著差异(P0.01)。形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其它组生长状态良好。因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。