马铃薯GLDH基因的克隆及序列分析

 以马铃薯品种‘Favorita’叶片中的cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（EC 1131213,GLDH）基因cDNA 2 563 bp的全长序列,命名为StGLDH（GenBank：FJ755844）。序列分析表明,该基因编码区长1 773 bp,编码590个氨基酸,与其他植物GLDH氨基酸序列具有很高的同源性,尤其与番茄、辣椒、烟草GLDH 氨基酸序列具有90.6% ~ 95.9%的同源性。荧光定量分析表明,该基因在马铃薯不同器官中均有表达,在幼叶和功能叶中表达量最高,在茎中表达量最低;除匍匐茎外,其它器官中抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）含量与StGLDH的表达高度一致。     

白菜β-1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜抗霜霉病品种‘雪克青’cDNA 为模板, 采用RT2PCR 技术, 获得了1032 bp 的β- 1,3- 葡聚糖酶基因的cDNA 序列。序列分析表明, 克隆的β- 1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA 序列编码343 个氨基酸, 与芜菁bg1 基因具有98 %的同源性, 与拟南芥bg2 基因具有84%的同源性。在GenBank 中登录号为AY395720 。     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

香蕉中一个新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及采后表达分析

利用抑制消减文库从香蕉中分离到一个cDNA片断,结合RACE技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1 285个碱基,通过Blastx同源性分析结果显示它与香蕉的一个S-adenosyl-L-methionine synthase(SAMS)基因(GenBank序列号为AF004317)具有82%的碱基同源性,编码的氨基酸顺序有93%同源性,但在cDNA的5’和3’非编码区同源性较低。设计特异引物对此基因进行RT-PCR分析表明,正常成熟的香蕉果实,采后当天表达量较高,随后略有降低,至采后12 d又达到一个相对较高值后迅速下降;高锰酸钾处理的果实,整个成熟期该基因均表现一个比较高的表达量;乙烯利处理的果实,采后表达量明显下降且处在一个比较稳定的水平。     

白菜病程相关蛋白1基因cDNA全长的克隆与分析

 以水杨酸处理后的‘苏州青’白菜为材料, 通过RT2PCR和RACE技术, 获得了白菜病程相关蛋白PR-1基因的cDNA全长序列。该基因与甘蓝型油菜PR-1基因氨基酸序列的同源性为91% , 与拟南芥的同源性为78% , 与其它植物的同源性为57%～60%。Southern杂交表明该基因在白菜基因组中的拷贝数至少为2个。半定量RT2PCR分析表明, 2 mmol/L的水杨酸处理后12 h, 该基因的表达量达到高峰。     

萝卜RsCYP86MF 基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

 本研究通过设计保守的基因特异引物, 运用SMART RACE RT - PCR技术从‘圆白’萝卜中获得一个细胞色素P450基因, 命名为RsCYP86M F, 其cDNA全长1818 bp, 含有1581 bp的完整开放阅读框, 编码526个氨基酸, 该基因编码的蛋白序列与白菜的细胞色素P450基因编码的氨基酸序列同源性高达90% , 且有很高的功能区段保守性; 对其可能编码的蛋白质二级结构进行预测发现, 该蛋白质具有细胞色素P450典型的保守结构域FNAGPRLCIG, 及N - 糖基化位点等结构域。     

茄子GA响应因子SmGAI的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE技术从茄子地方品种杭州红茄中扩增克隆了GA响应因子相关基因片段,命名为SmGAI,其cDNA序列为1 176 bp,含有972 bp的阅读框,编码323个氨基酸;基因编码的氨基酸序列与番茄单性结实调控基因SlDELLA同源性为76.8 %,高度相似。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

 从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacer^TM Kit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79%~82%之间，氨基酸序列同源性在88%～91%之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。关键词：     

矮牵牛PDS基因的克隆及其在shRNA介导的基因沉默中的应用

以矮牵牛(Petunia hybrida)自交系‘Mitchell Diploid’(MD)为材料,通过3′RACE和5′RACE获得了其八氢番茄红素脱氢酶基因(PhPDS)的cDNA序列,进而通过PCR扩增出编码区的基因组序列。分析结果显示,PhPDS的cDNA序列全长2 182 bp,编码区序列1 746 bp,编码582个氨基酸。推测的蛋白质序列具有类胡萝卜素脱氢酶的保守结构域特征。编码区的基因组序列长7 609 bp,结构与番茄和拟南芥等PDS基因相似,具有14个外显子和13个内含子。利用博德研究所的小发夹RNA(shRNA)设计程序设计了两个针对PhPDS的shRNA,构建植物表达载体转化矮牵牛后,从其中一个载体的转化子中获得白色愈伤组织和幼枝,对白色幼枝的RT-PCR检测表明,其PDS基因的cDNA累积量减少,表明shRNA基因沉默技术能在矮牵牛中应用。以PDS基因为靶基因比用花色素合成基因研究基因沉默技术能更快地分析基因沉默的效果,全长序列的获得将有助于PDS基因在矮牵牛基因沉默技术研究中的应用。     

茭白lea3基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

第3组胚胎晚期丰富蛋白(LEA3)是一组在胚胎发育后期丰富表达的蛋白,同时它还受水分胁迫和ABA的诱导,与植物抗旱性密切相关。本研究以经过干旱处理的茭白幼苗的mRNA为模板,根据禾本科lea3基因的保守序列设计简并引物进行RT-PCR,得到lea3基因的部分序列,然后结合RACE方法获得全基因两端的序列,经拼接得出茭白lea3基因的全长cDNA,序列分析结果表明该基因的开放阅读框为666bp,编码221个氨基酸,包含2个LEA3基元序列。通过与已报道的LEA3蛋白序列比较,与禾本科中水稻、大麦、小麦、雀麦、玉米的同源性分别为51.2%、41.0%、41.1%、42.0%和40.5%。最终得出结论,茭白lea3基因具有已知物种lea3基因的特征,可以为该基因的功能研究提供参考。目前,该基因已在GenBank中登录,编号为GQ494017。     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。     

Cloning and sequencing of heme oxygenase-1 gene from Ochotona curzo-niae

[ABSTRACT] AIM: To clone and analyze the heme oxygenase-1 (HO-1) gene from Ochotona curzoniae (plateau pika). METHODS: The cDNA of HO-1 was cloned by RT-PCR and rapid amplication of cDNA ends (RACE) from the liver of Ochotona curzoniae. The bioinformatic analysis of HO-1 gene was performed. RESULTS: The cDNA of HO-1 gene in Ochotona curzoniae was obtained. The data of the sequence was deposited into GenBank and the accession number is JX035934. The full length of cDNA was 1 466 bp, including 873 bp encoding sequence (290 amino acids). Homology comparison showed that the DNA sequence of the HO-1 gene was highly homologous with Oryctolagus cuniculus (89%), Homo sapiens (87%), Bos taurus (85%), Mus musculus (79%), Rattus norvegicus (84%), Sus scrofa (85%) and Equus caballus (85%), and the amino acid sequence of HO-1 was identified with the homology of 89%, 85%, 84%, 80%, 79%, 82% and 67%, respectively. Phylogenetic analysis suggested that the structure of HO-1 was highly similar to that in Oryctolagus cuniculus. CONCLUSION: The HO-1 gene of Ochotona curzoniae was successfully cloned and provides essential information for elucidating the possible roles of HO-1 in adapting of Ochotona curzoniae to extremely high altitude.     

洋葱成花素基因AcFT 的克隆与表达分析

 以春化后但尚未抽薹的洋葱品系‘1007’的叶片为试材,采用RT-PCR 结合RACE 的方法 克隆得到了洋葱成花素基因的cDNA 全长序列,将其命名为AcFT（GenBank 登录号为KF913629）。该基 因cDNA 全长791 bp,开放读码框为534 bp,推测其编码的蛋白由177 个氨基酸残基组成,等电点为7.89, 分子量为19.8 kD。将AcFT 与大葱、鸢尾等植物的成花素氨基酸序列进行同源性比对,结果显示洋葱与 其他植物的氨基酸序列同源性均在65%以上,其中洋葱与大葱的成花素氨基酸的同源性高达98.31%。实 时荧光定量RT-PCR 分析结果表明,洋葱AcFT 基因在抽薹前后的根、叶鞘、叶片、假茎和花序等不同部 位均有表达,尤以春化后抽薹前的叶片中表达量最高。     

Amplification and sequence analysis of anti-D variable region gene with leader peptide sequence

AIM:To amplify from leader peptide region and obtain human monoclonal anti-D variable region gene with high specificity and affinity, and analyze the nucleotide and deduced amino acid sequences.METHODS:The total RNA was extracted from an Epstein-Barr-virus-transformed cell line secreting monoclonal anti- (rhesus D) antibody. The leader region primers containing a ribosome recognition site were designed. By using PCR method, the cDNA of human anti-(rhesus D) antibody (IgM κ) variable region gene was amplified. Cloning and subsequent sequence analysis of the variable region gene was performed. The deduced amino acid sequence was also compared and analyzed with previously published sequences.RESULTS:A band of approximate 440 and 410 base pairs were amplified using heavy chain primers and light chain primers, respectively. Sequence analysis indicated that the deduced amino acid sequence was in agreement with the characterization of the amino acid present in the human Ig variable region. CONCLUSION:The cloning and sequencing of a human anti- (Rhesus D) antibody variable region cDNA will make benefits for production of recombinant anti-(Rhesus D) antibody and prevention of Rh haemolytic disease in newborns.     

黄瓜液泡膜H+-PPass基因CuPPase的cDNA克隆、序列分析与表达

 利用GenBank 登录的植物液泡膜焦磷酸酶氨基酸保守区序列设计简并引物,利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术从黄瓜叶片中获得了一个液泡膜H⁺-PPase 基因,命名为CuPPase,GenBank 注册号为GQ223786。CuPPase 蛋白与南瓜、绿豆同源性最高,分别为94%,92%。生物信息学分析表明,该基因全长2 650 bp,开放阅读框（ORF）2 307 bp,编码768 个氨基酸;CuPPase 蛋白大小约80 kD,理论pI值为5.32。该基因有14 个强的跨膜螺旋结构,PlantCare 分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温诱导、干旱诱导的顺式作用元件。RT-PCR 表明,CuPPase 在叶和根中表达较高,茎中表达较低。CuPPase表达受盐胁迫以及高温、低温胁迫诱导,但与处理时间有密切关系,其表达均表现先升高后降低的趋势。     

番茄果实酸性转化酶基因cDNA片段的克隆

根据酸性转化酶基因的保守序列设计引物 ,采用RT PCR方法 ,从番茄果实总RNA中扩增出目标cDNA片段 ,克隆到pMD18 T载体中。在所测的 10 38个核苷酸中 ,与GenBank中登记号为M810 81的番茄果实酸性转化酶基因高度同源 ,同源性为 99%。该基因片段在GenBank中已登记 ,登记号为AF4 90 5 30。     

羽衣甘蓝ARC1的基因分离、表达及与SRK相互作用的分析

 以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S_13-b S_13-b）为试验材料,利用RT-PCR的方法分离其ARC1基因cDNA序列（命名为BoARC1,GenBank登录号为EU344909）。BoARC1 cDNA序列中含有1个1 992 bp的开放读码框（ORF）,编码1个含有663个氨基酸的蛋白质。羽衣甘蓝BoARC1与油菜BnARC1的氨基酸序列具有94%的一致性;Southern杂交结果显示BoARC1在基因组中只存在单一拷贝;Northern杂交结果显示BoARC1特异性地在柱头组织中表达;在酵母双杂交试验分析中,BoARC1能够与SRK₃、SRK _13-b和SRK₉₁₀的胞内激酶域发生相互作用。