玉米细菌性枯萎病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

成功建立了玉米细菌性枯萎病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法.该方法根据细菌16S rDNA序列的特异性,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定性点突变特异性探针,并对10种细菌菌株和5种植原体进行了实时荧光PCR.结果表明,只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光信号,而其它参考菌不产生荧光信号,检测的绝对灵敏度是14.2 fg/μl质粒DNA,比常规的PCR电泳检测高约100倍.整个检测过程只需2h,完全闭管,降低了污染的机会,无须PCR后处理.     

利用双重PCR-DHPLC技术检测水稻细菌性谷枯病菌的研究

本研究建立了一种应用双重PCR结合变性高效液相色谱技术(polymerase chain reaction-denatured high performanceliquid chromatography,PCR-DHPLC)检测水稻细菌性谷枯病菌的方法。根据水稻细菌性谷枯病菌ITS序列(internal tran-scribed spacer)和gyrB基因序列,设计两对特异性PCR检测引物,对水稻细菌性谷枯病菌株和非水稻细菌性谷枯病菌株分别进行PCR-DHPLC及双重PCR-DHPLC检测,同时进行检测灵敏度及阳性菌株的同源性分析。结果显示,PCR-DHPLC检测的特异性强,灵敏度为菌浓度4×102cfu/mL,7株水稻细菌性谷枯病菌PCR产物同源性一致。该方法能简便、灵敏、高特异性地对水稻细菌性谷枯病菌进行高通量的自动化检测。     

杨树(细菌性)枯萎病菌快速检测方法研究

本文对杨树(细菌性)枯萎病菌的培养特征、生理生化特征、分子生物学特征等方面进行了研究与描述,设计并合成了特异性PCR引物,杨树(细菌性)枯萎病菌的PCR产物出现718 bp的特异性扩增条带,而其他近似种的细菌均未出现扩增条带,说明该对引物具有杨树(细菌性)枯萎病菌鉴定特异性,将病菌DNA模板做浓度梯度稀释,灵敏度可达10 pg/μL。该方法快速、灵敏、准确,可用于杨树枯萎病菌检测。     

玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法

为了提高口岸和基层实验室检疫和监测玉米细菌性枯萎病菌的准确性和工作效率,利用环介导恒温扩增技术(LAMP),根据内切葡聚糖酶(EGase)基因前导序列,设计2个内引物和2个外引物,对玉米细菌性枯萎病菌进行快速检测。结果表明,使用玉米细菌性枯萎病菌的近缘种或引致相似症状的病原菌菊欧文氏菌玉米致病变种Erwinia chrysanthemi pv.zeae、玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、燕麦假单胞菌Pseudomonas avenae、杓兰欧文氏菌Erwinia cypripedii检测其特异性,仅玉米细菌性枯萎病菌有扩增。LAMP检测灵敏度达到2 pg DNA,为普通PCR的100倍;与其它检测方法相比,LAMP方法检测时间短,效率高,不仅降低了设备投入,易于操作,而且具有较高的灵敏度和特异性,适合玉米细菌性枯萎病菌的现场检疫和大规模检测。     

玉米细菌性枯萎病菌PCR检测

 根据GenBank中玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的16S序列差异,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌特异性引物Ps2r/Ps3r,该引物能从供试的7株玉米细菌性枯萎病菌中特异性扩增出一条268 bp的预期条带,供试的32株近似种菌株都没有扩增产物;与国内外文献报道的其它5对特异性引物相比,除引物PSA/PSB外,引物DEP1/DEP2、ES16/ESIG2c、HRP1d/HRP3c和CPSL1/CPSR2c在不同程度上对部分近似种菌株出现了扩增。试验结果表明,引物Ps2r/Ps3r和PSA/PSB能特异性扩增玉米细菌性枯萎病菌,得到预期的扩增产物。对不同系列稀释度的DNA和玉米样品中病菌的检测结果表明,由引物Ps1/Ps4和Ps2r/Ps3r组合的巢式PCR方法的检测灵敏度高于引物ITSA/ITSB和PSA/PSB组合的巢式PCR方法,也高于Bio-PCR检测方法;前者可以检测到玉米种子中300 cfu/sample的目的细菌,该检测方法在进境玉米种子样品玉米细菌性枯萎病菌的检疫中具有比较理想的应有潜力和推广价值。     

一种快速鉴定玉米细菌性枯萎病菌的新技术——噬菌体株系鉴别法

利用８株玉米细菌性枯萎病菌噬菌体专化性的差异，结合氯化三苯基四氮唑（２，３，５－ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）对不同致病力细菌显色反应的不同，组成了一种新的细菌快速鉴定技术，称为噬菌体株系鉴别法，可鉴定玉米细菌性枯萎病菌直至株系。用这个方法鉴定了从美国、日本、南斯拉夫、西德和罗马尼亚进口的玉米种子中截获的许多玉米细菌性枯萎病菌菌株，结果准确快速，并和血清学鉴定及致病性测定的结果相一致     

番茄溃疡病菌的PCR-DHPLC快速检测

根据番茄溃疡病菌ITS序列,设计并合成了PCR-DHPLC检测引物,对番茄溃疡病菌及其他病菌共10个标准菌株进行了PCR-DHPLC检测。结果表明,番茄溃疡病菌的PCR-DHPLC检测图谱出现了特异性吸收峰,而其他病菌均未在相同洗脱时间出现吸收峰,说明这种方法具有检测番茄溃疡病菌的特异性。灵敏度实验结果表明,PCR-DHPLC体系与PCR-琼脂糖凝胶电泳体系的检测灵敏度一致。研究表明,PCR-DHPLC方法是一种特异、灵敏、快速的番茄溃疡病菌检测方法。     

利用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌

 根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。      

利用多重PCR诊断水稻白叶枯病和细菌性条斑病的复合发生

为准确检测水稻白叶枯病菌、细菌性条斑病菌及这两种病菌的复合发生,利用软件DNAStar分析比较这两种菌的部分核酸序列,设计了检测这两种病菌的特异性引物。引物Xoo F-Xoo R能特异性扩增出水稻白叶枯病菌中一条大小162 bp的条带;引物Xooc F1-Xooc R1和Xooc F2-Xooc R2能够分别特异性扩增出水稻细菌性条斑病菌中690 bp和945 bp的条带。通过优化PCR反应条件,成功建立了多重PCR技术,可以对不同国家的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌进行准确检测,对由这两种病菌引起的复合侵染实现了准确诊断。     

利用双重PCR技术快速检测水稻细菌性谷枯病菌

根据水稻细菌性谷枯病ITS和gyrB基因,设计两对特异性PCR检测引物,建立了水稻细菌性谷枯病菌的双重PCR检测方法。用该方法对水稻细菌性谷枯病菌和其它植物源性细菌进行双重PCR扩增及灵敏度测试,并对采自不同地区的水稻样本进行水稻细菌性谷枯病菌的检测。结果显示,双重PCR方法能特异性地检测出8株水稻细菌性谷枯病菌,可从含水稻细菌性谷枯病菌浓度为102cfu/mL的菌液中检测出该病菌;采用该方法对我国不同地区的水稻材料进行检测,并未发现水稻细菌性谷枯病菌。     

草莓角斑病菌检测鉴定技术研究进展

本文综述了近年来草莓角斑病菌(Xanthomonas fragariae)检测鉴定技术的研究进展.传统的鉴定方法主要有依赖田间症状识别、寄主接种鉴定、培养性状、生理生化鉴定、脂肪酸分析法(FAP)等;应用血清学鉴定检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、菌落免疫荧光染色法(IFAS)等,分子生物学检测方法主要有限制性片段长度多态性(RFLP)、聚合酶链反应(PCR)、巢式PCR、实时荧光PCR等.对于XF的检测鉴定不能单单依靠一种方法,应将多种方法结合起来进行最终判定,因此建立一套完整的检测鉴定技术体系十分必要.     

侵染唐菖蒲和百合3种病毒的多重RT-PCR检测方法

本文针对侵染百合和唐菖蒲的南芥菜花叶病毒、百合无症病毒和菜豆黄花叶病毒,建立了同时检测3种病毒的多重RT-PCR检测方法.该方法根据上述3种病毒保守的衣壳蛋白基因序列,设计特异性引物,优化了反应条件.通过对9种不同寄主和6种病毒的检测,验证该检测方法具有很高的特异性、稳定性,其灵敏度为植物总RNA稀释101～102倍.特别是,该方法缩短了检测周期,适合于植物病毒快速检测工作的需要.     

冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的快速分子检测

 由冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)引起的疫病是一类植物检疫性病害。为建立该病原菌的快速检测技术,本文比较分析了冬生疫霉和其它疫霉的ITS序列,在此基础上设计了一对检测冬生疫霉的特异性引物751F/752R,该对引物从冬生疫霉中扩增得到一条616bp的条带,而其它19种疫霉和其它真菌菌株均无扩增条带,表明该对引物对冬生疫霉具有特异性。在25μL PCR反应体系中,引物751F/752R检测灵敏度为10龟基因组DNA;而以卵菌ITS区通用引物ITS1/ITS4和751F/752R进行套式PCR扩增,能够检测到10ag的基因组DNA,使检测灵敏度提高了1000倍。该检测体系对灭菌水中游动孢子的检测灵敏度可达0.5个游动孢子。结合快速碱裂解法提取发病组织的DNA,采用该PCR检测技术,在1个工作日内即可从人工接种发病的植物组织中特异性的检测到该病原菌。表明本研究建立的检测方法可用于冬生疫霉的快速分子检测。     

几种常用植物病原细菌分子检测方法

植物病原细菌(phytobacteria)是植物上一类重要的病原菌,这些细菌能引起多种农作物、经济作物、花卉、树木及牧草上的病害。它的快速检测是病害防治、预测预报及植物检疫必不可少的重要工作。其中,以PCR为基础的分子检测技术的进步使植物病原细菌的检测更快速、灵敏和可靠。本文对近年来植物病原细菌分子检测技术进行介绍,尤其是应用广泛的ITS-PCR(intergenictranscribedspace-PCR)、ARDRA(amplifiedribosomalDNArestric-tionanalysis-PCR)、rep-PCR(repetitiveDNA-PCR)和实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)技术,旨在促进我国植物病原细菌研究的快速发展。     

柑桔黄龙病菌分子生物学研究进展

柑桔黄龙病菌属难培养韧皮部菌,由其引起的柑桔黄龙病是柑桔产业上的毁灭性病害,本文对柑桔黄龙病菌的菌系鉴别与分类、分子检测以及抗性育种进行了详细阐述。     

葡萄苦腐病菌的分子检测方法

葡萄苦腐病菌(Greeneria uvicola)是我国检疫性有害生物.本研究根据G.uvicola的ITS基因序列,设计了PCR引物GUA-1和GUA-2以及实时荧光PCR引物GUA-P1和GUA-P2及荧光探针GUA-Probe-117.利用引物GUA-1和GUA-2进行PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄可产生354 bp的特异性片段;实时荧光PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄均出现强荧光信号(△Rn)增加.而葡萄上其他常见真菌样品以及健康的红提葡萄既无特异性扩增也无荧光信号增加.灵敏度测试中,普通PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.05ng/μL以上的样品,实时荧光PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.0005 ng/μL以上的样品.由此确立了G.uvicola的两种稳定可靠、灵敏的分子检测方法.     

PCR法检疫鉴定番石榴实蝇

利用mtDNA序列,设计出两对特异性引物,应用定性PCR技术检疫鉴定番石榴实蝇.本方法适用于成虫鉴定和未成熟虫态(卵、幼虫、蛹)的快速检疫鉴定.     

马铃薯青枯病的PCR检测

以我国11个省(市、区)和6种不同寄主植物的43个青枯菌Ralstonia solanacearum代表性菌株和4个国外青枯菌菌株为试材,采用15条随机引物进行了RAPD分析,筛选到了1条青枯菌所特有的DNA片段,根据其碱基序列,设计了特异PCR引物,对不同青枯菌DNA进行扩增,并以马铃薯的其它病原细菌为对照,只有青枯菌可获得773bp的DNA扩增产物.经过对PCR反应模板制备程序的简化和优化,利用本研究设计的特异引物,直接对马铃薯病块茎的DNA粗提液进行扩增,获得了773bp片段.此技术可望用于马铃薯种薯青枯病菌的检测,大大缩短检测时间,提高检测效率.     

马铃薯类病毒(PSTVd)非放射性标记cDNA探针制备及其在检测上的应用

 利用含PSTVd单体克隆的重组质粒pGEM PSTVd,通过PCR扩增技术,用生物素标记制备cDNA探针,进行杂交反应检测PSTVd,其中通过化学颜色反应进行判读灵敏度可达50pg,而用化学发光反应进行判读灵敏度可达5pg,分别是R-PAGE检测灵敏度的26倍和260倍,且2种反应特异性和专化性较强。cDNA核酸斑点杂交反应(NASH)检测PSTVd方法准确、灵敏度高,一次检测样品数量多,且对异地样品检测非常方便,是以往其它检测方法的有效补充。     

聚合酶链反应技术在农药学研究中的应用

聚合酶链式反应是广泛应用的分子生物技术之一。本文简要介绍PCR技术的基本原理及它在杀虫剂、杀菌剂、除草剂以及抗性等方面的应用。