一例鸡金黄色葡萄球菌感染的分离与药敏试验

采集鸡关节肿胀渗出液、骨髓等进行细菌分离,对分离菌进行形态学观察、革兰氏染色、PCR鉴定、16S rDNA序列测定和药敏试验。经分离培养试验,从病鸡采集样品中分离出1株,在LB固体培养基上呈圆形,表面光滑湿润整齐有隆起,普通PCR检测16S rDNA结果呈阳性,细菌16S rDNA核酸序列Blast比对结果显示为葡萄球菌。分离菌对萘啶酸、磺胺复合物、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星具有耐药性。     

猪Ⅱ型链球菌分离鉴定与药敏试验

自某市猪场采集的病料中分离出了5株猪链球菌,进行血清型鉴定及毒力、耐药性研究。通过细菌分离培养、生化试验、PCR试验及耐药性对分离菌进行试验。鉴定此5株全为链球菌,其中3株为猪链球菌2型。对3株猪链球菌2型进行小鼠毒力试验及药敏试验,结果表明：分离的3株猪链球菌2型对小鼠均有毒力,分离菌株对万古霉素、利福平、氨苄西林、头孢拉定高度敏感,对复方新诺明、红霉素、卡那霉素、克林霉素、链霉素、强力霉素、青霉素G、四环素、新霉素耐药。     

草鱼肝胆综合症并发细菌疾病病原分离鉴定及药敏试验

对2016年6月江西省鄱阳县高家岭一个养殖场养殖草鱼发生的暴发性疾病进行病原分离鉴定及药敏试验,旨在确定其病因,为今后生产中有效防控该疾病提供参考。利用细菌分离方法在无菌条件下从患肝胆综合症草鱼体内分离、纯化致病菌,通过形态学、生化鉴定和16SrDNA序列分析、gyrB基因序列分析进行菌株鉴定,用攻毒试验找出草鱼的半致死浓度,并采用滤纸片扩散法进行药敏试验。从患肝胆综合症草鱼体内分离、纯化到一株致病菌,经鉴定为维氏气单胞菌,命名为PYG1。攻毒试验表明该菌能感染草鱼,且半致死浓度为1.5×10 ⁴ CFU/g鱼体质量。药敏试验结果表明该菌只对氨基糖苷类、第二代和第三代头孢类以及喹诺酮类的氧氟沙星共9种药物表现出敏感或中度敏感,对所测的其他药物耐药,为强耐药菌株。维氏气单胞菌PYG1是引起此次草鱼发病的致病菌,可选用氨基糖苷类、头孢类及喹诺酮类的氧氟沙星等药物进行防治。     

龙眼采后腐烂相关细菌与真菌的分离与鉴定

采用稀释涂布平板法,从龙眼腐烂果实中分离细菌和真菌,并结合菌落形态观察以及16S rDNA和ITS序列分析对所分离的细菌和真菌进行鉴定。结果表明,采用稀释涂布平板法,从龙眼腐烂果实中分离得到11株细菌和7株真菌。菌落形态观察以及16S rDNA和ITS序列分析结果表明,所分离的细菌主要鉴定为奥斯陆莫拉菌、短小芽胞杆菌、柠檬明串珠菌、肠膜状明串珠菌和东方醋酸菌。所分离的真菌主要鉴定为淡色生赤壳菌、葡萄座腔菌科真菌、间座壳菌、疖葡萄座腔菌和木贼镰孢菌。从龙眼腐烂果实中分离到的细菌和真菌目前在龙眼采后病害中未见相关报道,对于其致病性检测还有待于进一步的回接验证,以明确导致采后龙眼果实腐烂的主导微生物。     

特色传统食品大咯馇腐败菌分离及保鲜剂的筛选

分离和纯化了导致大咯馇腐败的主要微生物,并作为优选天然复合保鲜剂的供试菌。对大咯馇的初始菌相进行了分析比较,确定各种腐败菌的分离率为:细菌为96.83%,霉菌为3.16%,初步分离优势腐败细菌1株,并用最大浓度保鲜液对优势腐败菌在平板上进行了抑菌性试验,抑菌圈为3.70cm,效果显著。对保鲜剂的单一成分及浓度进行正交试验,筛选出复合保鲜剂的最佳配比为T1,T2,T3的质量分数分别为5.0%,0.4%,1.0%。     

6株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

对福建省一些猪场临诊疑似副猪嗜血杆菌感染的病例的病例进行细菌分离鉴定,PCR扩增分离菌株的16S rRNA并进行测序分析,对分离菌进行细菌形态和PCR鉴定及序列分析。结果显示,获得6株副猪嗜血杆菌分离株,该6株分离株之间的同源性在99%以上,而与国内外参考菌株序列之间的同源性在84.5%-99.2%。发育进化树分析结果表明,分离菌株与血清4型和5型的关系较近,与其他血清型关系较远。     

一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了确定安徽某中华鳖养殖场导致中华鳖发病的病原,为今后生产中有效防控该疾病提供参考。本研究无菌条件下从患病中华鳖体内分离病原,通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析对病原菌进行鉴定;利用回归感染试验对病原菌致病性进行确定,采用琼脂扩散法进行药敏试验,并对病原的毒力基因进行分析。结果从患病中华鳖体内分离纯化得到一株致病菌,命名为AM-1,经鉴定该菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);用该菌进行人工感染得到的症状与自然发病中华鳖症状一致;该菌对恩诺沙星和左氧氟沙星等药物敏感,对复方新诺明、氨苄西林和四环素等不敏感。毒力基因检测显示,该嗜水气单胞菌AM-1分离株携带气溶素、热不稳定性肠毒素、热稳定性肠毒素、溶血素、弹性蛋白酶5种毒力基因。最终表明嗜水气单胞菌AM-1是引起此次中华鳖发病的病原,可以使用恩诺沙星和左氧氟沙星等药物进行防治。     

克氏原螯虾细菌性病原的分离与鉴定

2010年浙江安吉克氏原螯虾养殖发生严重病害,从患病的虾肠道内分离到菌株N201007,人工感染健康克氏原螯虾在8天内其半数致死量LD50为5.3×105,感染发病虾表现出与自然发病虾相似症状。通过革兰氏染色,梅里埃细菌测定试剂条ID32 E鉴定为嗜水气单胞菌。为进一步确定病原菌分类地位,对其16S rRNA序列扩增并测序,在NCBI基因库上进行序列比对,与菌株ATCC7699同源性达到99%,通过以上实验确定导致此次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原为嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明该菌对强力霉素、氯霉素、恩诺沙星、环丙沙星、菌必治敏感。     

塔里木马鹿单核细胞增多性李氏杆菌的分离与鉴定

对马鹿流产胎儿的肝脏中的细菌进行分离和鉴定.用亚碲酸钾培养基分离流产胎儿的肝脏中的细菌,并用生化试验、人工感染试验、PCR和测序方法对分离的细菌进行鉴定.该分离株在生化试验、培养特性、溶血性等方面与单核细胞增多性李氏杆菌特性完全相符,能使接种小鼠在24～96h内100%死亡.测序结果表明,扩增P60基因片段与GenBank中报道的单核细胞增多性李氏杆菌强毒株EGD株P60基因核苷酸的同源性分别为99.1%,推导的氨基酸序列的同源性为99.6%.从塔里木马鹿成功分离的细菌为单核细胞增多性李氏杆菌强毒株.     

猪源绿色气球菌的分离鉴定及16S rRNA基因序列测定与遗传进化分析

为研究引起广东部分地区猪场仔猪发生急性死亡的致病菌及其系统发育地位,本研究从广东英德、惠州龙门、翁源、汕头等地区猪场急性死亡病仔猪中分离到6株呈α溶血的细菌。通过细菌形态学观察、生化特性鉴定、药敏试验、致病性试验以及16S rRNA基因的序列分析,确定为猪源绿色气球菌,分别命名为HD、WY、ZQ、LM、YD和ST。动物感染试验表明：6株分离菌株均具有不同程度的致病性;药敏结果显示：6株分离株均对头孢曲松、头孢唑啉、恩诺沙星、阿莫西林高度敏感,对新生霉素、利福平、阿米卡星、庆大霉素、多粘菌素B中度敏感,对其他抗生素均耐药;同源性及遗传进化分析结果显示：6株分离株与12株国内外参考菌株核苷酸同源性在93%以上,其中与澳大利亚分离自犬的15MS株同源性最高,为98.1%,与广西分离自猪的GXBL-1株同源性最低,为83.6%;6株分离株与广东分离株和澳大利亚分离株亲缘关系最近,暗示进化不存在明显的地域相关性。本研究确定了广东部分地区引起规模化猪场仔猪发生急性死亡的病原菌,为该菌引起的疾病的防治提供了依据。     

甘草、黄连等五味中药对体外抗菌作用的研究

为验证清热解毒类中药体外联合抗菌协同指数(SI)判定标准的适用性。采用微管-平板法测定甘草(Radix glycyrrhiza)、黄连(Rhizoma coptidis)、金银花(Flos lonicerae japonicae)、黄柏(Cortex phellodendri chinensis)和秦皮(Cortex fraxini)的水提物和乙醇提取物对猪链球菌Ⅱ型的抗菌活性,用棋盘微量肉汤稀释法测定这五味药不同提取物两两配伍的协同指数,然后将其组方,分别水煎煮和醇提取,并测定其对猪链球菌Ⅱ型的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,黄连和秦皮配伍SI为0.5,甘草和秦皮、甘草和金银花的SI都为0.75,甘草和黄连组方后醇提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为7.81 mg/mL,甘草和秦皮组方后醇提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为1.95 mg/mL,黄连和黄柏组方后的水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为0.98 mg/mL,黄连和秦皮组方后水提物对猪链球菌Ⅱ型的MIC为1.95 mg/mL。由此表明,黄连醇提物和秦皮水提物的体外联合的协同作用明显,黄连和黄柏药对的水提物对猪链球菌Ⅱ型的抑制作用较好。     

温度诱变选育透明质酸产生菌

以兽疫链球菌为出发菌种,从血琼脂平板上筛选出不具溶血性的突变菌,采用恒温、变温进行诱变处理,同时对各菌株进行发酵培养比较。结果表明,相对于原菌株,变温诱变菌株的透明质酸产量有显著提高,产量由1.99g/L提高到2.95g/L,增加率为48%。     

CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

猪瘟病毒C株重组标记疫苗的构建

利用构建的猪瘟病毒C株感染性克隆作为骨架,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因作为标记基因,将GP5基因引入猪瘟病毒感染性cDNA中,体外转录得到RNA,转染SK6细胞后,检测了传代细胞中重组猪瘟病毒包含GP5区段的一段重组序列。结果表明,GP5基因稳定地插入在重组病毒基因组中,改造后的重组病毒可望作为C株活病毒标记疫苗。     

猪附红细胞体对树突状细胞成熟的影响研究

为了观察树突状细胞(dendritic cell,DC)2.4的表型和功能变化,以反映猪附红细胞体(Mycoplasma suis,M. suis)对DC成熟分化的影响。通过将DC2.4分成5组：空白对照组：不进行任何处理;实验组：M. suis 0.1、1.0、10.0 μL/mL组,分别在培养液中加入相应剂量的纯化M. suis;阳性对照组：加入脂多糖,终浓度1 μg/ml。应用流式细胞术检测DC2.4培养24 h后细胞表面抗原CD80、CD86、MHC-Ⅱ类分子的表达,并采用MTT法检测同基因混合淋巴细胞反应观察DC2.4对T细胞的抗原提呈能力。流式结果表明：M. suis刺激DC2.4后抑制表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达,表达量均低于阳性对照组(P<0.01),且对DC2.4的抑制作用呈现剂量依赖。混合淋巴反应中M.suis显著抑制DC2.4对T细胞的激活能力,且阳性对照组与空白组之间差异有显著性意义(P<0.01)。本研究证明了M. suis可以抑制DC2.4的分化与成熟,M. suis刺激的DC2.4在免疫反应中发挥负性调节作用,为M. suis的免疫研究提供科研数据。     

百球清对仔猪等孢球虫病治疗效果观察

为了研究百球清（Toltrazuril）对猪等孢球虫病的治疗效果,用15 mg/kg.bw和7.5mg/kg.bw2个剂量的百球清口服治疗感染猪等孢球虫（Isospora suis）的7日龄仔猪,用粪便性状及腹泻持续时间、OPG值及排卵囊持续时间、增重率、死亡率及剖检病变等指标来判定百球清治疗效果。结果显示,首次给药后第5—6天给药组（Ⅰ、Ⅱ组）仔猪粪便性状全部恢复正常,首次给药后第3—4天Ⅰ、Ⅱ组仔猪粪便卵囊转阴率达100%,仔猪精神、食欲等明显好转,除Ⅰ组死亡1头外,组其余仔猪全部存活。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组仔猪2周内增重率分别为65.1%、61.9%和34.7%,Ⅰ、Ⅱ组仔猪增重率提高显著（P<0.01）。而感染不给药组（Ⅲ组）仔猪首次给药后1周仍有少量卵囊排出,死亡2头,存活仔猪明显消瘦。表明百球清对仔猪等孢球虫病具有良好的治疗效果。     

附红细胞体感染后红细胞相关免疫因子的研究

为了检测小鼠感染附红细胞体后红细胞相关免疫因子的功能受影响,用猪附红细胞体阳性血感染BALB/c小鼠,在第1,3,5,7,9天后采用ELISA方法检测小鼠红细胞表面CD35和血浆中CD35、CD58和CD59水平变化。结果表明,小鼠感染猪附红细胞体后红细胞表面CD35分子水平逐渐降低;第1,3,5,7,9天后,血浆中CD35、CD58和CD59水平分别高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),且第3天血浆CD35、CD58和CD59水平达到高峰。说明小鼠感染猪附红细胞体后红细胞表面CD35降低,血浆中CD35、CD58和CD59出现升高现象,且高峰均出现在第3天。试验表明,小鼠感染附红细胞体后红细胞表面CD35、CD58和CD59分子受到破坏,影响了红细胞的免疫功能,进一步可影响到机体的整个免疫系统的功能。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系,本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24,48 h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明：用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。     

猪附红细胞体感染BALB/c小鼠试验研究

为了解现阶段延边地区猪附红细胞体的致病性。本试验以注射地塞米松和摘除脾脏的BALB/c小鼠为实验动物,以腹腔注射方式人工感染猪附红细胞体,通过临床症状观察、血液涂片姬姆萨染色镜检及PCR方法对BALB/c小鼠感染猪附红细胞体情况进行了鉴定,并进行了血液常规检测。结果表明：注射地塞米松组、摘除脾脏组和正常感染组BALB/c小鼠在感染后8~10天相继达到高峰,正常感染组BALB/c小鼠在感染后第24天猪附红细胞体消失,注射地塞米松组在感染后第32天消失,而摘除脾脏组在试验结束时仍具有较高的感染率。经血液常规检测,各组BALB/c小鼠在感染猪附红细胞体后,白细胞总数显著升高(P<0.01),淋巴细胞总数、红细胞总数、血红蛋白含量均显著下降(P<0.05),红细胞比容显著下降(P<0.01)。本试验证实猪附红细胞体对低免疫力的BALB/c小鼠具有一定感染性,并表现出典型临床症状。     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。