大豆与棉花抗性基因类似物的同源性比较及其进化分析

已知许多植物抗病基因的蛋白质产物具有保守的结构域 ,如NBS、LRR、TM等。根据烟草的N基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS 2基因的保守序列设计了 1对简并引物 ,并以应县小黑豆基因组DNA为模板 ,PCR扩增获得 16个不同的RGA片段 ,大小在 470～5 45bp ,且不同程度地含有抗病基因的保守序列 ,如GGVGKTT、GSRII、GLPL等。与已知大豆、棉花RGA进行比较 ,发现该试验获得的大豆RGA和用相同引物扩增获得的棉花RGA核酸序列以及相应的氨基酸序列之间同源性较低 ,与已经克隆的大豆RGA及其氨基酸序列之间相似性较高。在分子水平揭示了大豆及棉花RGA的起源及其进化。     

甘薯中NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及序列分析

根据已知的NBS-LRR类抗病基因蛋白质的保守序列设计简并引物,用以扩增甘薯基因组中的抗病基因同源序列,获得一条大小约500 bp的扩增片段,克隆测序后得到20个NBS-LRR类抗病基因同源片段RGAS。其推导的氨基酸序列均具有P-loop、Kinase-2a和Kinase-3a及GLPL区等几个保守区,并且可分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两个亚类。其中10个TIR亚类RGAS与已克隆的N、L6、M等抗病基因相应区段的氨基酸序列的同源性为21%-44%,而10个non-TIR亚类RGAS与已克隆的Prf、RPM1、RPS2等抗病基因相应区段的氨基酸序列的同源性为15%-46%。这些抗病基因同源片段(RGA)可做为分子标记筛选甘薯的抗病候选基因。     

不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析

【目的】利用同源序列法分离不结球白菜抗病基因同源序列。【方法】根据植物抗病基因TIR-NBS-LRR保守区设计简并引物，对不结球白菜基因组DNA及cDNA进行PCR扩增。【结果】获得了10个具有通读氨基酸序列的片段。同源性比较发现，该10个片段均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为50%～66%。与已知抗病基因聚类分析结果显示，该10个RGA序列可以分为5大类。利用RGA950作为探针进行Southern杂交，结果表明，其在基因组中存在多拷贝。【结论】本研究成功获得了不结球白菜RGA序列，为进一步克隆不结球白菜的R基因奠定了基础。     

甘薯抗病基因同源序列的克隆与分析

对根据紫花苜蓿（Medicago truncatula）NBS区域的保守序列等设计的16对简并引物进行优化,筛选出6对简并引物,以甘薯的基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆甘薯抗病基因同源序列（RGA）。结果克隆出342个不同的甘薯RGA,这342个甘薯RGA和已知的抗病基因历、N、RGCl等具有高度同源性（Evalue〈e×10^-20）。根据抗病基因同源序列的相似性,利用Cluxtalw软件将其分为22个不同的类群。这些甘薯的抗病基因同源序列已提交GenBank（编号：DQ903322至DQ903664）。在342个甘薯RGA中,除7个是TIR外,其余属于DOD—TIR类型。用Blastx和DNAman软件对342个甘薯RGA进行列队比较,发现有9个含有抗线虫病RGC1序列的RGA,它们与RGC1的同源件为50％～100％．     

桃基因组中R类抗病基因同源序列的克隆与序列分析

许多抗病基因均具有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复区(LRR)。根据已知的NBS-LRR型抗病基因蛋白质的保守序列,设计简并引物,用以扩增桃基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500 bp的扩增片段,克隆测序后得到4个NBS-LRR类抗病基因同源片段(PNBS1、PNBS2、PNBS3、PNBS4)。推导的氨基酸均具有P-loop(激酶1a)保守区和中间的激酶2a、激酶3a保守区,除PNBS4外,均具有3端疏水结构域。它们与已克隆的N、L6、PRS2 等抗病基因在核苷酸水平上的同源性为21 1%~58 8%;在氨基酸水平上的同源性为18 8%~41 4%。这些抗病基因同源片段(RGA)可做为分子标记筛选桃的抗病候选基因。     

辣椒NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

辣椒RGA的分离将为进一步从辣椒中分离功能性抗病基因和抗病机理分析打下基础,为辣椒相关抗病基因的克隆提供依据。根据已知抗病基因保守氨基酸结构域设计简并引物,以高抗辣椒品种88为试材,通过PCR扩增抗病基因同源序列。结果表明:从辣椒基因组DNA中分离出1条辣椒抗病基因同源序列WD1。对其编码的氨基酸序列进行分析表明:该序列同时含有P-环(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3(GSRII)及HD(即GLPLAL)保守域结构,分离的辣椒抗病基因同源序列(RGA)与已报道的辣椒抗病基因同源序列A5和A13都有99%的同源性。     

柚cDNA中NBS-LRR类R基因同源序列的分离

 提取柚花柱的总RNA，通过逆转录合成其cDNA，根据已知植物抗病基因（R基因）的NBS保守区设计简并引物，对cDNA进行扩增，获得大小约为500 bp的PCR产物，对连接产物进行酶切归类，筛选得到不同类别的克隆12个，并进行了测序。通过序列同源比较分析发现，其中有10个片段属于NBS-LRR类抗病基因的同源序列（RGA），与已知植物R基因相应区段的氨基酸序列的同源性为11.5%～47.1%。     

江苏水稻品种抗稻瘟病遗传多样性研究

根据已知的不同抗病基因保守区域设计引物,通过在水稻基因组DNA中扩增和分离有相似序列的DNA片段,可以快速鉴定出候选抗病基因。选择3对扩增条带多样性较高的引物XLRRfor／XLRRrev、S1／AS3和Ptokin1／Ptokin2,对江苏27个水稻品种进行抗病基因同源序列PCR分析（resistance gene analog—PCR,RGA—PCR）。结果显示,3对引物共扩增出清晰可辨的谱带127条,其中多态性带1ol条,占总数的79．53％。根据聚类分析,3对引物对或引物组合扩增的RGA图谱可将品种分为多种类型,这些RGA图谱类型与稻瘟病菌7个生理小种接种鉴定的抗病表型没有完全的对应关系。     

辣椒抗黄瓜花叶病毒同源序列的克隆与分析

根据已知抗病基因的核苷酸结合位点(NBS)保守结构域设计简并引物,以高抗黄瓜花叶病毒的辣椒Yv2007001为试材,获得10条抗病基因同源序列(RGA).经序列分析,这些RGAs皆具有开放阅读框和NBS保守结构域(P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、RNBS-C和GLPL),属于nonTIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列.其中RGA46与番茄花叶病毒抗性基因Tm-22的氨基酸同源性为78%,可能与辣椒抗黄瓜花叶病毒(CMV)相关.其它序列与已知抗病基因Prf、RPP13、I2C-1、Mi-1.2、L6、M氨基酸相似性为21%～70%.所得RGA序列的Ka/Ks值为0.011 0～0.305 1,均显著小于1,表明"纯化选择"在辣椒NBS区域进化中起主要作用.     

烟草(云烟87)NBS-LRR类同源抗病基因克隆及分析

[目的]克隆并分析烟草NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGAs),为采用同源克隆技术挖掘烟草抗病基因提供理论参考.[方法]从基于NBS-LRR类抗病基因保守序列设计的简并引物中筛选扩增效果较好的引物用于扩增烟草RGAs,采用DNAMAN 6.0翻译成氨基酸序列,并与已知的其他植物抗病基因进行聚类分析.[结果]克隆获得6条与参比抗病基因具有高度同源性的烟草RGAs,大小在500 bp左右,但仅有4条RGAs具有连续的开放阅读框(ORF)及编码NBS功能结构域的核苷酸序列,命名为TRGA-87-1~TRGA-87-4.这4个烟草RGAs编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病蛋白的多个典型保守基序,与已知的多种植物抗病基因编码的氨基酸序列均具有较高的相似性,其中,与烟草相关抗病基因编码的氨基酸序列相似性最高,为97.00%~100.00%,与其他植物的抗病基因编码氨基酸序列相似性为29.00%~53.00%,这些序列可分为3个亚类,其中TRGA-87-2与烟草N和亚麻L6聚为一类(TRGAⅠ),属于TIR-NBS-LRR类;TRGA-87-3和TRGA-87-4与水稻Xa-1和番茄Mi聚为一类(TRGAⅡ),属于non-TIR-NBS-LRR类,TRGA-87-1与拟南芥RPM1聚成一类(TRGAⅢ),属于non-TIR-NBS-LRR类.[结论]同源扩增技术可用于烟草中抗病基因的克隆、功能分析及定位等研究.     

棉花NBS抗病基因的发掘

根据已克隆的R基因的保守序列设计引物,在棉花不同抗性品种中克隆出500 bp左右大小片段,克隆测序并在NCBI上进行Blast分析,发现这些序列除一个序列外均与已经克隆的抗病基因类似物(RGAs)同源,且同源性高达98%以上。将这些从棉花中克隆的RGAs和植物中已克隆的几个典型的R基因序列建立进化树,棉花中的RGAs序列分别聚在3个不同的亚家族,可以通过后续的功能验证来确定这些序列片段的功能。     

巴西橡胶NBS—LRR抗病基因类似物多样性分析

【目的】克隆巴西橡胶抗病基因同源序列,为巴西橡胶抗病R基因的获取奠定基础。【方法】根据已知抗病基因（Resistance gene, R gene）编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计一对简并引物 P1/P2,采集经水杨酸（SA）处理0、12、24、48 h的巴西橡胶叶片,进行cDNA同源序列克隆。【结果】序列分析结果表明,克隆获得的RGAs经系统进化分析分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR 两种类型和9个基因家族;多重比较发现,克隆获得的RGAs具有典型的NBS类抗病基因保守结构域,在与已知植物NBS类序列相似性比较中,与I2c-2基因相似性最高,为46.2%,而巴西橡胶NBS类RGAs之间氨基酸相似性为22.1%～100.0%。进一步研究发现,核苷酸非同义替换和同义替换的比率小于1,有低水平的重组,表明点突变逐步积累是导致纯化选择的主要力量。【结论】通过SA诱导作用和NBS类抗病基因结合得到的巴西橡胶NBS类RGAs具有广泛的遗传多样性,并与已知抗病基因氨基酸序列具高度相似性,这些RGAs候补序列可能与某抗病基因有密切联系。     

巴西橡胶NBS-LRR抗病基因类似物多样性分析

【目的】克隆巴西橡胶抗病基因同源序列,为巴西橡胶抗病R基因的获取奠定基础。【方法】根据已知抗病基因（Resistance gene, R gene）编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计一对简并引物 P1/P2,采集经水杨酸（SA）处理0、12、24、48 h的巴西橡胶叶片,进行cDNA同源序列克隆。【结果】序列分析结果表明,克隆获得的RGAs经系统进化分析分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR 两种类型和9个基因家族;多重比较发现,克隆获得的RGAs具有典型的NBS类抗病基因保守结构域,在与已知植物NBS类序列相似性比较中,与I2c-2基因相似性最高,为46.2%,而巴西橡胶NBS类RGAs之间氨基酸相似性为22.1%~100.0%。进一步研究发现,核苷酸非同义替换和同义替换的比率小于1,有低水平的重组,表明点突变逐步积累是导致纯化选择的主要力量。【结论】通过SA诱导作用和NBS类抗病基因结合得到的巴西橡胶NBS类RGAs具有广泛的遗传多样性,并与已知抗病基因氨基酸序列具高度相似性,这些RGAs候补序列可能与某抗病基因有密切联系。     

核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性

【目的】利用同源序列法分离核桃的NBS（Nucleotide binding site）类抗病基因类似物,为核桃抗炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础。【方法】以35个核桃优系为试材,利用接种法鉴定供试材料对炭疽病的抗性;根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,以核桃优系的基因组DNA为模板,通过PCR扩增NBS类抗病基因同源序列片段,并分析所得NBS类抗病基因类似物与核桃优系炭疽病抗性的关系;利用BLASTN/X程序对所得NBS序列在GenBank数据库中进行同源性搜索;利用MEGA 5.2及DNAman 7.0等软件对其进行序列相似性分析和系统进化研究。【结果】35个供试核桃优系中,有20个优系为抗炭疽病类型（R）,其相对抗性指数在0.63-0.82;有5个优系为中抗类型（M）,相对抗性指数在0.27-0.56;有10个为感病类型（S）,相对抗性指数在0.00-0.21。PCR结果显示,从20个抗炭疽病优系的基因组扩增得到20条NBS类抗病基因类似序列;而在其它15个优系（5个中抗优系和10个感病优系）中未扩增到条带,表明核桃NBS序列与炭疽病抗性相关联。BLASTN显示,所得NBS序列在核苷酸水平与GenBank中已知的核桃NBS序列(jrRGAPGs)存在89%-100%同源性,与其它物种NBS序列的同源性在69%以上;BLASTX显示,所得NBS序列与已知核桃NBS抗病蛋白同源性为77%-99%,与其它物种的NBS抗病蛋白同源性在49%-66%。氨基酸序列多重比对分析表明,所得核桃NBS序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域,如P-loop、kinase-2、kinase-3和GLPL等,在典型功能域的核苷酸多态性（Pi）明显低于非保守区,有较高保守性。系统发育分析表明,在核苷酸水平上可将所得核桃优系的NBS序列区分为7类,在氨基酸水平上可分TIR和non-TIR两大类7个亚类;所得核桃NBS序列非同义替换率(dN)和同义替换率(dS)的比值dN/dS在0.00-0.95,为纯化选择。氨基酸序列相似性表明核桃优系不同NBS亚类间的相似度为28.3%-63.5%,与已知抗病基因相应区域的氨基酸相似性为22.0%-48.5%。【结论】核桃NBS类抗病基因类似物与炭疽病抗性相关联,NBS序列与其他物种抗病基因有较高同源性,包含抗病基因保守的功能域,在进化上为纯化选择。     

小麦抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与分析

RGA(抗性基因同源序列)法是克隆植物抗性基因的一种经济有效的方法,成为近年来的研究热点。本实验综合分析了拟南芥,西红柿,水稻,烟草等植物已克隆的抗性基因,并以这些抗性基因的NBS(核酸结合位点),LRR(富含亮氨酸重复),STK(丝氨酸/苏氨酸激酶)保守结构域设计并合成了几十对RGA引物,对小麦抗条锈病材料进行PCR扩增,获得以Xal-NBS为引物的R88RGA片段,经克隆和序列比对分析,发现该片段与逆境条件下植物抗病信号传导相关,与蛋白激酶同源性达到96%。此项研究对抗病机理的研究和基因的发掘有重要的指导意义。     

薄壳山核桃MADS—box基因保守片段的克隆与序列分析

【目的】克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS—box家族基因及其发育的分子机理奠定基础。【方法】以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT—PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS．box家族基因进行系统发育分析。【结果】分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65．7％-98．5％,其推导氨基酸序列中有11个存在差异。系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归人拟南芥MADS．box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因。【结论】薄壳山核桃中存在多种MADS．box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

薄壳山核桃MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

【目的】克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS-box家族基因及其发育的分子机理奠定基础。【方法】以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT-PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析。【结果】分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137 bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65.7%~98.5%,其推导氨基酸序列中有11个存在差异。系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因。【结论】薄壳山核桃中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。