MEF2a基因在肌肉组织中的表达研究

分别取90日龄、180日龄和270日龄大白猪心肌、背肌和腿肌,提取总RNA,设计并合成猪MEF2a引物,以β肌动蛋白作为内参,利用Real-time PCR方法检测不同日龄大白猪肌肉组织中MEF2a基因mRNA的表达。结果表明,不同日龄大白猪的心肌和背肌中,MEF2a基因mRNA的表达水平无显著差异,在腿肌中有显著差异（P<0.05）。从90日龄到270日龄,MEF2a基因在心肌、背肌和腿肌的表达水平均差异显著（P<0.05）,腿肌最高,其次是背肌,心肌最低。据此推测,MEF2a基因在猪成体后的肌肉组织中,主要是促进Ⅰ型肌纤维的生成,而不再是介导细胞分化。     

不同猪种肝脏中 CstB 基因的表达研究

为了研究Cst B基因在大白猪、野猪及野家杂交猪肝脏组织中表达情况,采用RT-PCR技术对不同品种猪只进行检测,结果表明,肝脏中Cst B基因的表达在90,180,360日龄的大白猪表达量较低,其他个体表达量相对较高。     

Cst B基因在90日龄大白猪不同组织中的表达研究

采用RT-PCR技术,对90日龄大白猪心肌、肝脏、胃、肾脏、肺、大肠、小肠、背肌和腿肌组织中表达情况进行研究,得到Cst B基因在肾脏、肺、大肠和小肠中有较高的表达,而在心肌、背肌和腿肌等肌肉组织中表达量相对较低。     

牦牛PIK3CB基因克隆及其在卵泡发育过程中的表达研究

旨在探讨磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基β(Phosphoinositide-3 kinase, PI3K,catalytic subunit beta, PIK3CB/P110β)基因序列特征,比较分析其在牦牛不同发育阶段卵泡中的表达规律。通过RT-PCR技术从牦牛卵巢组织中克隆获得PIK3CB基因序列并对其进行生物信息学分析;采用RT-qPCR方法检测PIK3CB基因在牦牛不同组织中的表达水平;将采集的牦牛卵泡根据直径大小分为大(≥7 mm)、中(3.0～6.9 mm)、小(≤2.9 mm)3组,分别收集各组卵泡中的壁颗粒细胞及卵母细胞提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测PIK3CB mRNA在各级别卵泡壁颗粒细胞及卵母细胞中的相对表达量。结果显示:克隆获得牦牛PIK3CB基因CDS区长3 213 bp,共编码1 070个氨基酸。蛋白质分析显示,PIK3CB蛋白为亲水酸性蛋白,无跨膜结构无信号肽,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。PIK3CB核苷酸同源性及遗传进化树分析显示,牦牛与野牦牛和黄牛亲缘关系最近。PIK3CB基因在牦牛心脏、脾脏、肾脏、肌肉、肝脏、肺脏、子宫、胃、小肠、卵巢组织中均有表达,尤其在脾脏、子宫和卵巢组织中表达量显著高于其他组织(P0.05)。RT-qPCR结果显示,PIK3CB基因在卵泡发育过程中均有表达,其中在各级别卵泡壁颗粒细胞中,mRNA表达量随着卵泡发育进程呈现上升趋势,且大、中级别卵泡中的表达量极显著高于小卵泡组(P0.01);但是卵母细胞中mRNA表达量差异不显著(P0.05)。结果提示,mRNA基因参与了牦牛卵泡发育调控,是PI3K信号通路在调节颗粒细胞的功能中不可或缺的催化亚基之一,具体调控机制有待进一步研究。本研究为深入探讨PI3K-AKT信号通路在卵巢发育中的调控机理提供基础资料。     

猪LXRα基因的克隆、序列分析及表达研究

采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪的肝脏组织中克隆出了猪基因的LXRα(Liver X Receptors α)cDNA序列,编码区长度1344bp,编码447个氨基酸,基于Pfam数据库发现存在一个锌指蛋白和核受体的配体结合区;系统发育分析发现猪的LXRα所在的哺乳动物类群非常保守,与鸡和斑马鱼所构成的类群存在较大遗传距离;在大白猪和杂种野猪的脂肪组织中检测表明LXRα基因的表达自3月龄至12月龄逐渐增加,并在9月龄达到最高,而杂种野猪在9月龄开始高表达,12月龄最高.研究结果表明LXRα基因可能是猪脂质代谢的重要分子标识之一.     

牛GDF-9基因的克隆与组织表达的分析

为了检测牛GDF-9基因mRNA在怀孕期牛生殖系统的表达情况,为GDF-9基因在雌性动物繁殖上的研究提供一定的理论依据。本试验根据GenBank中报道的牛GDF-9基因序列设计引物,从牛卵巢、输卵管、子宫、肾脏中提取RNA,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物与载体pGM-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序。结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为264 bp。序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与绵羊GDF-9cDNA和氨基酸序列同源性分别为97%和94%。以-βactin为内参照物,采用RT-PCR技术进行半定量分析,通过检测比较牛GDF-9基因在卵巢、输卵管、子宫、肾脏组织中mRNA的表达情况。结果表明,牛GDF-9基因在卵巢中表达量最高,在输卵管、子宫、肾脏中均有表达,但表达量不高。     

猪LXRα基因的克隆、序列分析及表达研究

采用 RT-PCR 结合克隆测序的方法,从猪的肝脏组织中克隆出了猪基因的 Liver X Receptors α cDNA 序列,编码区长度1344bp,编码447个氨基酸,基于Pfam数据库发现存在一个锌指蛋白和核受体的配体结合区;系统发育分析发现猪的LXRα所在的哺乳动物类群非常保守,与鸡和斑马鱼所构成的类群存在较大遗传距离;在大白猪和杂种野猪的脂肪组织中检测表明LXRα基因的表达随着月龄的增加也不断增加,并日趋稳定,而杂种野猪在9月龄开始高表达,12月龄最高。     

大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

为了克隆分析大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因的cDNA序列,并研究该基因的组织表达规律。采用RT-PCR和RACE法,从大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)肌肉中分离和克隆大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因。结果表明：大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因全长1710 bp,其中5 '-UTR长73 bp,3 '-UTR长509 bp,编码区长1128 bp,编码375个氨基酸。大鳞副泥鳅β-肌动蛋白与其他鱼类氨基酸的同源性大于98%,核苷酸同源性大于87%;系统进化分析表明：大鳞副泥鳅β-肌动蛋白在进化上高度保守;qRT-PCR结果表明：β-肌动蛋白基因在大鳞副泥鳅的肌肉、心、肝、脾、肠、胃、精巢和卵巢共8种组织中都有表达。研究结果不仅为利用β-肌动蛋白基因作为内参基因分析大鳞副泥鳅的基因表达研究提供了序列依据,而且可为大鳞副泥鳅的分子系统学研究提供序列参考。     

绵羊PRLH及其受体基因的克隆及在下丘脑-垂体-性腺轴中差异表达的研究

为了探讨PRLH及其受体基因在绵羊性腺轴中的表达,以绵羊下丘脑-垂体-性腺轴系为研究对象,克隆了PRLH及其受体基因PRLHR,构建了系统进化树,并利用qRT-PCR技术对PRLH及其受体基因在绵羊性腺轴中不同组织的表达差异做了研究。结果表明,绵羊PRLH和PRLHR mRNA核苷酸序列分别为113,237 bp,PRLH基因核苷酸序列与山羊、牛、人、小鼠的同源性分别为96.8%,93.3%,80.3%,74.6%,PRLHR基因与藏羚羊、山羊、牛、人和小鼠的同源性分别为100%,99.3%,97.3%,90.4%,84.4%;PRLH及其受体基因在绵羊的下丘脑、垂体、子宫和卵巢中均有一定量的表达,且PRLH基因在下丘脑、垂体和卵巢中的表达要显著低于子宫(P0.05);PRLHR在子宫与垂体中的表达差异显著(P0.05),其他差异不明显。说明下丘脑、垂体、子宫和卵巢是PRLH合成分泌和发挥作用的主要器官。     

大蒲莲猪不同发育阶段组织RT-qPCR分析中适宜内参基因筛选

利用适宜数量且表达稳定的内参基因对目的基因的表达量进行标准化是获得准确、可靠RT-qPCR数据的重要条件。以不同日龄大蒲莲猪8种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠组织、肌肉、血液)为试验材料,使用ge Norm、Norm Find软件对8个常用候选内参基因(ACTB、B2M、GAPDH、RPL4、SDHA、TBP、YWHAZ、PPIA)的表达稳定性进行分析,筛选适宜内参基因及其组合。ge Norm、Norm Find软件联合分析结果表明,不同日龄大蒲莲猪心脏中表达最稳定的内参基因为TBP、PPIA和YWHAZ,肝脏、肾脏、肠组织和肌肉中最稳定的内参基因均为TBP和PPIA,脾脏中表达最稳定内参基因为TBP和RPL4,肺脏中表达最稳定内参基因为TBP、RPL4、PPIA和ACTB,血液中表达最稳定内参基因为ACTB、YWHAZ和GAPDH。由于大蒲莲猪8种体组织中最适宜内参基因组合和数量不同,因此内参基因筛选是进行RT-qPCR数据分析的必要条件。结果可为研究大蒲莲猪目的基因表达时适宜内参基因的选择提供帮助。     

鸭胚胎骨骼肌TR-β mRNA发育性表达及与肌重相关性研究

为探讨TR-β基因在不同品种鸭胚胎期和出雏早期胸肌和腿肌中表达的发育性变化及其对胸腿肌重的影响。采用实时荧光定量PCR方法研究了高邮鸭和金定鸭胚胎期(17,21,25,27胚龄)和出雏早期(7日龄)胸腿肌中TR-βmRNA的表达水平。结果表明,TR-β mRNA在2个品种鸭肌肉早期发育中表现出一致的表达规律,但在腿肌和胸肌的发育性变化规律稍有不同:在胚胎期胸肌和腿肌中的TR-β mRNA表达量均呈先低后高的趋势,27胚龄时表达量最高;但出壳后胸肌中的TR-β mRNA表达量出现显著下降(P<0.01),而腿肌仍维持高水平表达(P>0.05)。表明TR-βmRNA表达具有显著的胚(日)龄依赖性,并存在组织差异,但无品种差异。鸭发育早期胸腿肌中TR-βmRNA表达量与胸腿肌重的相关性分析表明,两者呈强的正相关,提示胸腿肌中TR-βmRNA的表达可能在鸭早期胸腿肌发育过程中发挥着正调控作用。     

牦牛ANXA5基因的克隆、序列分析及表达研究

为了深入地讨论牦牛ANXA5基因序列的特点，阐述其组织及细胞表达特性，通过采集牦牛不同组织样品，如心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、输卵管等，提取总RNA。采用PCR、生物信息学软件、实时荧光定量PCR、免疫组化等技术对牦牛ANXA5基因进行克隆、序列分析及表达特性研究。结果显示，牦牛ANXA5基因CDS区长为966 bp,共编码321个氨基酸。与黄牛比较，发现共有6个碱基突变存在于牦牛ANXA5基因中。黄牛与牦牛的核苷酸和氨基酸同源性大于99%,与其他哺乳动物进行氨基酸同源性比较，结果也均在90%以上，说明ANXA5基因在长期进化中保守。在牦牛的肺组织中，ANXA5基因表达量最高，与其他组织差异极显著(P<0.01);在子宫和输卵管组织中表达量次之。ANXA5在牦牛不同时期卵巢颗粒细胞中均有表达，且表达量随时间增长而逐渐升高。结果显示，培养72 h颗粒细胞中ANXA5表达量极显著高于培养24,36 h颗粒细胞(P<0.01);培养48 h颗粒细胞中ANXA5表达量极显著高于培养24 h颗粒细胞(P<0.01),显著高于培养36 h颗粒细胞(P<0.05),表明A...     

牦牛DDIT3基因克隆及组织表达特性分析

旨在探究DNA损伤诱导转录本3(DDIT3)基因序列特征及其在母牦牛组织表达特性。以母牦牛为研究对象,利用RT-PCR技术克隆牦牛DDIT3基因,利用生物信息学软件分析DDIT3蛋白的结构和功能,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测DDIT3基因在牦牛不同组织及不同生理阶段的生殖器官和卵母细胞中的表达特征。结果显示:牦牛DDIT3基因CDS区全长507 bp,共编码168个氨基酸;核苷酸序列比对发现,牦牛与野牛同源性最高,为99.71%,与其他物种的同源性均在88%以上,说明DDIT3基因在进化过程中表现出高度保守性;牦牛DDIT3基因在卵巢中的表达量极显著高于心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、子宫和输卵管(P0.01);在卵巢中,妊娠期DDIT3基因的表达水平显著高于卵泡期、黄体期和胎儿期(P0.05),黄体期的表达量显著高于胎牛期(P0.05);在子宫中,妊娠期DDIT3基因的表达水平显著高于卵泡期和胎牛期(P0.05);DDIT3在各时期输卵管中表达水平差异不显著;MⅡ期卵母细胞中DDIT3基因的表达水平显著高于GV期和MⅠ期(P0.05),MⅡ颗粒细胞DDIT3基因的表达量也显著高于GV期和MⅠ期(P0.05),GV期、MⅠ期的卵母细胞和颗粒细胞DDIT3表达量差异不显著。综上,牦牛DDIT3基因可能在维持母牦牛卵巢机能与妊娠以及卵泡发育与成熟过程中发挥重要的调控作用。     

槐猪和杜洛克猪瘦素及其受体基因的差异表达研究

为了解7月龄、12月龄的槐猪和杜洛克猪5个不同部位脂肪组织LEP和LEPR基因的表达差异。采用荧光定量PCR技术,使用2-△△Ct方法计算LEP和LEPR基因的相对表达量,结果表明：LEP基因在背部皮下脂肪下层的表达量最高,其次是背部皮下脂肪上层、腹部皮下脂肪和板油,在冠状动脉脂肪中表达最低;7月龄槐猪脂肪组织LEP基因的表达量与12月龄槐猪、7月龄杜洛克猪差异显著(P＜0.05),12月龄槐猪脂肪组织LEP基因表达量与7月龄杜洛克猪差异极显著(P＜0.01)。7月龄槐猪脂肪组织LEPR基因的表达量与12月龄槐猪相比,只有冠状动脉脂肪差异显著(P＜0.05)。     

猪TAK1基因的cDNA全长克隆、时空表达及亚细胞定位分析

为了研究转化生长因子β激活激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)在猪骨骼肌生长发育中的作用,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得猪TAK1的cDNA全长,并分析其时空表达及真核细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,TAK1 cDNA全长2 163 bp(Gen Bank登录号:KU504629),ORF为1 740 bp,编码579个氨基酸,其氨基酸序列与人、恒河猴、绵羊的相似性均为98. 8%,表明该蛋白在不同物种间高度保守。猪TAK1蛋白具有催化丝氨酸/酪氨酸磷酸化的STKc_TAK1结构域,而在该结构域中还有多个保守的ATP结合位点、A-Loop结构域、TAB1(TGF-beta activated kinase 1)结合位点。荧光定量PCR结果显示,TAK1基因在出生后120 d大白猪的免疫器官脾脏中表达量最高,胰腺、背最长肌等组织中的表达量较低;而不同发育时期的背最长肌中,该基因在胚胎期65 d表达量最高,随着生长发育表达量下调;在不同品种间,TAK1基因在各时期大白猪中的表达量均高于梅山猪,除出生后90 d外,其他时期差异均达到显著水平或极显著水平。pcDNA3. 1(+)-EGFP-TAK1重组质粒转染C2C12细胞后的荧光共定位结果显示,TAK1蛋白的表达主要集中在细胞质中。综上,TAK1基因在猪骨骼肌发育过程中起着重要作用,为进一步研究猪TAK1基因的功能奠定了基础。     

藏鸡GEM基因克隆及其时空表达特性分析

旨在获得藏鸡GEM基因序列,阐明其组织表达和时序表达谱,同时分析基因表达与肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉积的关系,为进一步研究藏鸡肉质和脂肪沉积奠定基础。选取1,81,119,154,210日龄健康藏鸡为试验材料,屠宰后分别采集心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌和皮下脂肪组织,提取组织总RNA,利用RT-PCR技术克隆藏鸡GEM基因序列,利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在藏鸡不同组织以及不同发育时期胸肌和腿肌的表达情况。结果表明,克隆获得藏鸡GEM基因序列940 bp(Gen Bank登录号:KY747399),其中,CDS为894 bp,5'UTR 24 bp和3'UTR22 bp,编码297个氨基酸,与原鸡、绿头鸭、人和小鼠GEM氨基酸序列相似性较高(83.50%~98.32%);组织表达结果显示,GEM在藏鸡肺组织中的表达水平最高,极显著高于其他组织(P0.01),在脂肪组织和脾组织中也存在较高水平的表达;时序表达结果显示,GEM基因在不同发育阶段藏鸡胸肌和腿肌中的表达模式存在差异,在胸肌中的表达水平随日龄的增加呈下降趋势,而在腿肌中随日龄的增加呈先上升后下降的表达趋势,且在119日龄达到峰值;GEM基因表达水平与不同发育阶段藏鸡胸肌和腿肌中IMF含量呈不同程度的相关,存在性别差异,且在公藏鸡腿肌中达到显著水平(r=0.414,P0.05)。结果表明,GEM基因可能在藏鸡脂质代谢中起重要调控作用。     

β-catenin在人工诱导发情绵羊子宫的表达研究

为探讨β-catenin在人工诱导发情绵羊子宫组织中的表达情况,本试验采用实时荧光定量PCR与半定量PCR检测绵羊发情后第10、12、14、16、18天子宫组织中β-catenin mRNA的表达情况。实时荧光定量PCR与半定量PCR结果显示:2种检测方法均能检测出不同时期的绵羊子宫中β-catenin mRNA表达,其中绵羊发情后第10天β-catenin mRNA的相对表达量最大,显著高于其他4个时间点(P0.05),第12天相对表达量显著降低(P0.05),之后相对保持恒定,到第18天又显著升高(P0.05)。结果表明:实时荧光定量PCR与半定量PCR均可用于检测绵羊子宫组织中β-catenin mRNA的相对表达量;在绵羊发情后第10~18天,β-catenin在子宫中的呈现先减少后增加的波动变化趋势。     

山东省八个猪种繁殖、肉质、抗病基因多态性分析

利用PCR-RFLP等技术检测了山东省8个猪种(莱芜黑猪、大蒲莲黑猪、烟台黑猪、新沂蒙黑猪、里岔黑猪、五莲黑猪、鲁烟白猪和昌潍白猪)606个样品的繁殖(FSHβ、ESR和PRLR)、肉质(Hal~n)和抗病(FUT I)性状的主要功能基因的多态性分布,结果表明:山东省猪种上述5个基因均具有丰富的多态性,特别是FSHβ、ESR和PRLR 3个影响繁殖性状有利基因的基因频率很高,是其高繁殖性能的基础.Hal~n和FUT I基因在中外猪种间有不同的分布特征,通过Hal~n和FUT I基因在中外猪种间频率的对比,初步分析了山东省各猪种受国外猪种的影响的程度,为山东省猪种遗传资源的保护和开发利用提供基础资料和科学依据.     

兰州鲇Dmrta1基因克隆及其组织时空表达规律

为了解Dmrta1基因的生物学特性及其在兰州鲇生长发育中的生理作用，以及为加快实现全雄兰州鲇群体生产提供理论依据和技术支撑。采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得兰州鲇Dmrta1全长cDNA序列，通过qRT-PCR技术检测该基因在兰州鲇胚胎发育、仔稚幼鱼以及3龄雌雄异体和3龄雌雄同体不同组织中的表达特征。结果表明，兰州鲇Dmrta1基因cDNA全长1 415 bp, ORF全长1 158 bp,共编码385个氨基酸，包含20种氨基酸；经SMART预测显示，该基因属于典型的Dmrta亚家族蛋白，具有保守的DM和DMA结构域。同源性比对和系统进化树分析结果表明，兰州鲇与南方鲇的相似性最高(95.47%),且亲缘关系最近。组织表达结果表明，Dmrta1 mRNA在未受精卵粒及胚胎发育各个时期均有表达，而在未受精卵粒中表达最高(P<0.05);在兰州鲇孵化后40 d内不同发育时期中，Dmrta1 mRNA在同期XX个体组织中表达均显著高于XY个体，且在35 d迅速达到峰值(P<0.05);Dmrta1 mRNA在3龄雌雄异体兰州鲇雌性卵巢、鳃和雄性鳃组织中表达显著...