菠菜性别相关的ISSR标记

菠菜为雌雄异株植物,用CTAB法提取其雌、雄株成株幼嫩叶片DNA,分别构建雌、雄株DNA池,以之为模板,用已优化的ISSR体系扩增,在74条ISSR引物中,I62扩增出一条约1 200bp雌性连锁标记,回收纯化该特异扩增片段,将其连接于pUCm-T载体,转化进大肠杆菌JM109菌株,并检测及测序。回收克隆和测序后发现该片段全长1 176bp,富含AT,AT占57.0%。根据测序结果设计1对25bp的特异引物将这个雌性连锁的ISSR标记转化为稳定性和特异性更好的SCAR标记。该特异引物对随机选取的雌雄菠菜单株进行PCR扩增,在雌株中均有1 176bp的特异条带,而雄株中均无。此特异条带的获得为菠菜性别相关基因的克隆奠定基础。     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348 bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

利用AFLP方法筛选中华绒螯蟹性别相关标记

利用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术筛选中华绒螯蟹性别相关标记,共使用192对引物组合检测中华绒螯蟹雌、雄和雌雄混合3个基因组池的多态性,共扩增出5 376条多态性条带,平均每对引物组合扩增出28条多态性条带,获得88条雌雄差异条带。利用雌雄各10个个体再次进行AFLP验证,共62条差异条带具有性别差异,包括两种情况:(1)有49条条带在雌性的4～6个个体中存在,在雄性全部个体中缺失;(2)有13条条带在雄性4～6个个体中存在,在所有的雌性个体中缺失;其余的26条没有性别差异性。差异条带经回收、克隆、测序,结果发现有些条带包含多个序列,共得到77条DNA序列,其中31条序列与鸟类、两栖类和哺乳类等脊椎动物性染色体DNA部分片段具有同源性,相似区间在22～212 bp不等,其中6条DNA序列与命中序列之间具有生物学相关性。设计特异性的引物在基因组中检测,没有获得性别特异SCAR标记。     

百日草细胞核雄性不育基因的RAPD标记研究

试验以百日草雄性不育两用系AB201中的不育株和可育株为供试材料,采用BSA法和RAPD技术,在64个随机引物中筛选与育性基因紧密连锁的分子标记,结果发现引物BE-05在DNA纯合可育池和杂合可育池中扩增出一条长约1 500 bp的特异谱带,在DNA不育基因池中未发现特异谱带,该标记在3个育性不同的DNA池之间表现稳定的差异。用建池的单株DNA进一步对这个引物进行RAPD分析,发现仍表现稳定的多态性,该标记与育性基因MS紧密连锁,命名为BE-051500。     

高番茄红素加工番茄品系的RAPD引物筛选及特异片段的克隆

以加工番茄高茄红素近等基因系为材料,分别从高茄红素含量及低茄红素含量植株中提取DNA构建DNA池,采用RAPD技术,从260个随机引物中筛选出1个在2基因池间具有特异性的引物S636,在轮回亲本及回交后代单株的DNA中进行验证,证明了该引物扩增出的特异性片段是1个与番茄耐高茄红素含量连锁的RAPD标记.经琼脂糖凝胶电泳回收扩增出的特异条带与载体pMD-18T连接,并转入大肠埃希菌DH-5α,对克隆片段测序结果表明其实际大小为827 bp,这为转化成稳定的SCAR标记奠定了基础.     

膜荚黄芪和蒙古黄芪的RAPD指纹图谱分析研究

利用RAPD标记对膜荚黄芪和蒙古黄芪进行了指纹图谱的研究.采用BSA法从100个10碱基随机引物筛选出7个在膜荚黄芪基因池和蒙古黄芪基因池中表现多态性的引物.单株检测表明,引物OPC06具有膜荚黄芪特异性,在检测的膜荚黄芪个体中均能扩增出1条710 bp左右的特异带,而在蒙古黄芪的单株中未见扩增特异带,因此,将该膜荚黄芪扩增特异性条带命名为OPC06-710.试验表明,利用RAPD标记可在分子水平上达到快速、准确、可靠地鉴定膜荚黄芪和蒙古黄芪的目的.     

樟科16个树种木材的RAPD与ISSR分子鉴别

采用随机扩增多态性(RAPD)和简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)技术鉴别樟科Lauraceae16个树种。用改良十六烷基三甲基溴化铵-十二烷基硫酸钠(CTAB-SDS)法提取樟科16个树种192株(12株·种-1)木质部基因组DNA,用RAPD与ISSR技术对它们进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。共筛选出8条RAPD引物与6条ISSR引物,8条RAPD引物共扩增出165条大小为100~2 000 bp的条带,其中多态性条带为153条,多态率为92.7%;6条ISSR引物共扩增出96条大小为100~2 000 bp的条带,其中多态性条带为86条,多态率为89.6%。通过1~2个引物扩增的多态性条带就可鉴别与区分参试的16个树种,为树种鉴定提供技术支持。     

甜瓜雄全同株和雌雄异花同株的RAPD标记

以甜瓜雄全同株和雌雄异花同株近等基因系为试验材料,选用300条随机引物进行性型性状的RAPD标记.结果表明:S152号引物经多次重复均能扩增出清晰、稳定且有差异的DNA条带,在雄全同株的植株中能扩增出一条分子量约为550 bp的特异条带,标为S152550.在F2代分离群体中,根据特异标记在田间实际雄全同株与雌雄异花同...     

基于序列特异扩增区域标记的栗疫菌巢式PCR检测技术

为建立栗疫菌(Cryphonectria parasitica)快速、准确的检测技术,利用随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD)对不同来源地的栗疫菌和其他真菌分离物进行PCR扩增,筛选出栗疫菌的RAPD特异片段SCQ494。将特异RAPD片段SCQ494进行分离、回收,与载体pMD19-T载体连接,转化至大肠埃希菌进行培养,对目标片段克隆测序。根据测序结果,用Primer 5.0软件设计了序列特异扩增区域(sequence characterized amplified region,SCAR)引物CQ1/CQ2和巢式PCR引物CR1/CR2。利用引物CQ1/CQ2通过常规PCR对不同来源地供试栗疫菌可扩增出1条约1 420bp的条带,对其他供试菌株DNA的PCR产物均无此条带,检测灵敏度为3pg/μL的基因组DNA;而以引物CQ1/CQ2为外圈引物和引物CR1/CR2为内圈引物进行的巢式PCR可从栗疫菌基因组DNA中扩增出1条大小约875bp的条带,灵敏度达到30fg/μL,是常规PCR的1000倍。验证实验表明巢式PCR可以从发病程度不同的栗树枝干和在自然感染的栗树枝条中检测出栗疫菌。     

"夏光"、"早夏16"甘蓝杂交种DNA指纹图谱的构建

用SDS法提取甘蓝(Brassica oleraceavar.capitata)杂交种“夏光”、“早夏16”及其各自亲本的基因组DNA,通过SSR、RAPD两种分子标记方法构建其DNA指纹图谱用于纯度鉴定。利用30对甘蓝SSR引物和50个适用于甘蓝的RAPD引物,以各杂交种及其亲本的基因组DNA为模板组合进行筛选,结果显示:多数SSR引物对两组合扩增带型一致,未能建立SSR指纹图谱;通过RAPD标记方法筛选出能鉴定两杂交种纯度的引物分别为S15、S42、S147和S42、S78、S88,其中引物S42对两组合均能扩增出特异的RAPD指纹图谱,并将RAPD指纹图谱转变为相应的数字指纹。     

温敏型亚麻雄性不育系育性相关基因的RAPD初探

通过优化组合,建立了适合本试验的亚麻基因组DNA最佳RAPD反应体系;应用分离群体分组分析法(BSA),利用1S×Argus杂交组合F2分离群体所构建的可育基因池(BF)和不育基因池(BS)进行育性基因的RAPD标记分析.经多次重复试验,在所用的240条10 bp随机引物中筛选出1条多态性引物S1113,其序列为:CACGGCACAA.S1113在可育基因池中扩增出大小约为450 bp的多态性DNA片段,暂命名为S1113450,可能与亚麻温敏雄性不育系可育基因连锁.     

十字花科蔬菜根肿病菌的PCR检测

 利用设计合成的1对根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）特异性寡聚核苷酸引物（前引物:5’GAA GAT GCC CAC GCC GTC GT3’和后引物:5’ATC TGT TCA GCA AAG CGT CGA3’）,对分离自十字花科作物（白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等）及土壤中的根肿病菌全基因组DNA进行PCR（Polymerase Chain Reaction）特异性扩增试验。试验结果表明,试验设计合成的引物能从十字花科根肿病菌全基因组DNA中扩增到629 bp长度的分子片段,该对引物可用于十字花科蔬菜根肿病的分子鉴定和分子监测,为十字花科根肿病的早期准确诊断和病菌检测提供了快速、简便的方法。     

白杂1号种子纯度的RAPD鉴定技术研究

以白菜型油菜新品种“白杂1号”父母本及F1代种子为研究材料,用238个10-mer随机引物对它们进行了RAPD分析鉴定,结果显示共有68个随机引物出现多态性扩增,DNA片断大小在0.17~1.8 kb之间。经多次重复验证,引物S24、S83和S104条带稳定,并且杂交种条带为双亲互补型;引物S176为偏父型,在母本中扩增出350 bp特征带,而其在父本中呈阴性。选取S104(GGAAGTCGCC)对两个亲本及F1建立指纹图谱,共检测出6条强带,其中380 bp是母本特征带,1 600 bp是父本特征带。人为掺杂构建“白杂1号”F1代测试群体,用S104对其进行了纯度检测,结果与预期结果基本一致。对RAPD方法在鉴定种子纯度中的有关双引物混合扩增和条带判断取舍问题进行了讨论。     

6种葫芦科瓜类蔬菜亲缘关系的RAPD分析

以6种葫芦科(Cucurbitaceae)瓜类蔬菜为试验材料,优化基因组DNA提取条件,用RAPD技术分析不同瓜类蔬菜基因组DNA的遗传多样性。结果表明:改良SDS法和改良CTAB法均能成功提取DNA,后者提取的DNA产量高,纯度较好,适合遗传多样性研究。用60条随机引物进行扩增筛选,有8条引物扩增条带清晰,呈现多态性,共扩增出94个条带,大小为200~3 000 bp。RAPD104软件显示:苦瓜与丝瓜、黄瓜、茭瓜、南瓜和佛手瓜的成对遗传距离指数分别为0.4393,0.4583,0.6000,0.5735,0.7306。NTSYS-PC程序的UPGMA聚类分析表明:同属的南瓜和茭瓜亲缘关系最近,其次是苦瓜与丝瓜;苦瓜与黄瓜亲缘关系较近,与南瓜和茭瓜较远,与佛手瓜亲缘关系最远。     

中国落叶松杨栅锈菌4个流行小种的RAPD标记

以156条随机引物,对目前中国落叶松杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb)的主要优势菌系进行了RAPD片段的筛选,寻找到了1号3、号4、号5、号4个流行生理小种的特异性RAPD标记。经过多批次扩增,引物S205和S284分别得到1号生理小种长度约450和760 bp的特异条带,S25得到3号生理小种长度约1440 bp的特异条带,S51和S286得到4号生理小种长度约970和1020 bp的特异条带,S23和S96分别得到5号生理小种长度约750和780 bp的特异条带。此结果表明,通过寻找落叶松杨栅锈菌生理小种的特异性RAPD片段,能够建立起中国落叶松杨栅锈菌生理小种的分子检测体系。     

生防真菌球毛壳ND35的RAPD特异序列的标记转换

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对包括球毛壳ND35在内的20个真菌分离物进行分析,筛选出球毛壳ND35的RAPD扩增特异性DNA片段,经pEASY—T3载体克隆和测序、Seqman整合后,用Primer5．0软件设计了球毛壳ND35的特异引物对CgND35—1：GTTGCCAGCCCGAGGGGAAG,CgND35—2：G111ACCAGCCATGCCTTGAAG,经优化PCR条件,成功获得球毛壳ND35的SCAR标记,该标记片段长度为329bp。用CgND35—1／CgND35—2引物对进行了SCAR标记特异性和灵敏度检测,表明该特异引物可用于球毛壳ND35的快速检测。     

高浓度畜禽废水污染胁迫下的芦苇在分子水平上的变异研究

为了探讨芦苇在高浓度畜禽废水污染胁迫下遗传特性的变化,将人工湿地试验池中生长的,受高浓度畜禽废水长期污染胁迫的和未受到污染的供试芦苇材料各20个单株幼芽分别混合提取DNA,采用RAPD分子标记技术在160个随机引物中进行筛选。找到3个能够扩增出差异且重复性较好的RAPD引物：S74、S516和S14。结果表明,在高浓度畜禽废水长期污染胁迫下,芦苇在DNA水平上产生了变异,其变异产生的特异性扩增片段可能与芦苇抗污染基因紧密连锁,芦苇在高浓度畜禽废水污染胁迫下的抗污染旺盛生长特性也可能与这种变异有关。同时,本研究结果能为在分子水平上进一步揭示人工湿地植物的强去污能力机理和抗污染特性提供参考依据。