静原鸡let-7a-5p的靶基因预测及组织表达分析

【目的】了解let-7a-5p的生物学信息,初步探索其在静原鸡肌肉组织中的功能作用。【方法】利用生物信息学方法对转录组测序获得的静原鸡let-7a-5p的成熟序列进行保守性分析,使用miRDB、TargetScan和miRanda在线软件预测let-7a-5p的靶基因,取其交集进行GO功能和KEGG通路富集分析,并利用实时荧光定量PCR检测let-7a-5p在静原鸡公鸡和母鸡各组织中的表达水平。【结果】let-7a-5p的成熟序列在各物种间高度保守,共预测得到38个基因集合。在生物过程、细胞组分和分子功能中靶基因富集较多的GO条目有细胞过程、生物调节、细胞、结合和催化活性;靶基因显著富集于聚酮糖单元生物合成、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解、TGF-β信号通路和加压素调节的水重吸收信号通路,且富集最多的是代谢途径、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路。let-7a-5p-靶基因互作主要通过作用于靶mRNA的3′-UTR抑制表达或使其降解。组织表达发现,let-7a-5p在静原鸡公、母鸡的心脏、肝脏、脾脏、...     

猪let-7a靶基因预测及生物信息学分析

旨在通过对ssc-let-7a进行靶基因预测及生物信息学分析,探究其调控猪卵泡发育和闭锁的作用机制。利用荧光定量PCR技术对猪卵泡期不同状态的3种中等(3～5 mm)卵泡(健康卵泡(H)、早期闭锁卵泡(EA)和晚期闭锁卵泡(PA))的颗粒细胞中ssc-let-7a表达变化进行比较研究,利用过表达let-7a检测其对H_2O_2诱导颗粒细胞氧化损伤的保护作用;应用JASPAR、PROMO、Cytoscape等生物信息学软件和miRBase、Ensembl、NCBI等数据库对ssc-let-7a进行转录因子结合位点预测、保守性分析、靶基因预测、GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。结果表明:随着卵泡闭锁程度的加深,ssc-let-7a在颗粒细胞中的表达水平发生显著下调;过表达ssc-let-7a对H_2O_2诱导猪颗粒细胞氧化损伤具有保护作用;ssc-let-7a在各物种间非常保守,其启动子区域有FoxO1/3等多个转录因子结合位点,278个靶基因主要参与细胞增殖、凋亡和分化生物学过程,其主要参与MAPK、TP53和TGF-β等信号通路。由此推测,ssc-let-7a受到FoxO等多个转录因子调控,它可能通过参与MAPK、TGF-β和TP53等通路的调节从而影响颗粒细胞的增殖或凋亡,进而影响猪卵泡发育。     

鸡miRNA let-7b靶向调控GHR基因的双荧光素酶验证

miRNA是一类大小约为22 nt的内源性非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA相结合而影响其功能,进而调控动物的生长发育过程。miRNA靶基因预测软件发现,生长激素受体(GHR)基因是miRNA let-7b的候选靶基因之一。GHR基因作为生长激素基因的受体基因,在鸡的生长发育过程中具有极其重要的作用。试验采用双荧光素酶报告系统对其靶向关系进行验证。结果表明:GHR mRNA 3′UTR存在与let-7b相结合的靶标位点(UACCUCA);Let-7b过表达载体与GHR验证载体共转染组的荧光素酶相对活性只有0.159,明显下降,表明miRNA let-7b靶向负调控GHR 3′UTR,存在确切的靶标关系。研究结果可为进一步揭示let-7b介导GHR基因在鸡生长发育过程中的调控作用提供参考。     

山羊皮肤组织miRNA测序与miR-129-5p调控黑色素生成的功能研究

旨在筛选对黑色素生成起调节作用的小RNA,并探究其对山羊肤色及毛色的调控机制。本研究采集了健康酉州乌羊(Youzhou dark goat, YZDG)、川东白山羊(Chuandong white goat, CDWG)100日龄胎羊皮肤样本(n=3),和健康2～3周岁大足黑山羊(Dazu black goat, DBG)、内蒙古绒山羊(Inner Mongolia cashmere goat, IMCG)个体皮肤样本(n=3),利用组织切片染色技术观察皮肤中黑色素沉积情况;通过小RNA测序技术筛选差异miRNAs;培养B16-F10皮肤黑色素瘤细胞,利用细胞转染、qPCR、Western Blot、黑色素含量检测等技术验证miR-129-5p对黑色素生成的影响。结果显示,黑色素颗粒明显在YZDG胎羊皮肤和DBG毛囊的毛球、毛干、外根鞘等部位沉积,而在CDWG胎羊皮肤和IMCG表皮、毛囊中没有被观察到。经测序分析,在肤色差异的YZDG和CDWG中筛选到62个差异表达miRNAs,其中31个在乌皮山羊中上调,31个下调。在毛色差异的DBG和IMCG中,筛选到38个差异表达miRNAs,其...     

hsa-miR-21-5p靶基因预测及生物信息学分析

【目的】试验旨在对hsa-miR-21-5p的序列保守性和靶基因进行生物信息学分析,为进一步探讨其在卵母细胞成熟过程中的功能及调节机制提供思路。【方法】从GEO数据库获取人卵母细胞不同成熟阶段对应的卵丘细胞基因表达谱数据(GSE31681),利用R软件筛选差异表达基因(DEGs),通过FunRich软件预测DEGs的靶向miRNAs,找出hsa-miR-21-5p靶向的DEGs,获得miRNA-mRNA关系对;利用BLAST程序进行相似性比对,通过Mega 11.0软件构建系统进化树,采用ViennaRNA Web Services预测pre-miR-21-5p的二级结构;使用miRTarBase网站预测hsa-miR-21-5p靶基因,并进行GO功能和KEGG通路富集分析;通过STRING数据库建立蛋白质互作网络,并利用Cytoscape软件进行可视化分析。【结果】共筛选出7个卵母细胞成熟过程中GV/MⅡ期对应卵丘细胞中hsa-miR-21-5p靶向的DEGs。对物种间miR-21-5p序列分析发现,人pre-miR-21-5p与小鼠、褐家鼠、黄牛、绵羊、笔尾树鼩、猕猴的相似性均达9...     

急性冷应激大鼠肝脏中novel-miR-133-5p生物学功能预测

本研究旨在检测6种novel microRNA(novel-miR-1-5p,novel-miR-6-3p,novel-miR-9-3p,novel-miR-25-5p,novel-miR-133-5p和novel-miR-287-3p)在急性冷刺激大鼠肝脏中的表达情况,并对novel-miR-133-5p的生物学功能进行分析,预测了novel-miR-133-5p在冷应激大鼠肝脏内的功能。前期冷应激大鼠血清高通量测序试验的结果中发现这6种差异表达的novel microRNA。本试验采用了30只12周龄SPF级Wistar雄性大鼠,体质量(350±10)g,将大鼠放置人工气候室预饲7d,预饲温度为(24.0±0.1)℃。随机分成急性冷应激组(CSS)和常温对照组(NTS),对CSS急性冷刺激12h后,冷刺激温度为(4.0±0.1)℃。采取肝脏提取总RNA,应用qRT-PCR方法检测6种novel microRNA在急性冷刺激大鼠肝脏的表达情况。结果显示,6种novel microRNA在急性冷刺激大鼠肝脏均有表达,除novel-miR-9-3p外,其余的都显著升高,novel-miR-133-5p升高的最为明显(P0.01)。对novel-miR-133-5p进行生物学信息分析发现,novel-miR-133-5p的靶基因有2 048个,其中bcl9与wnt11肿瘤的发生、增殖和迁移有关;同时wnt11也对正常细胞的增殖、分化和凋亡也有重要影响;Smarcal1是一种DNA结合蛋白,可以修复因损伤而停止复制的DNA。结果表明,在大鼠血清中存在的6种novel microRNA同样存在于冷应激大鼠肝脏中,在冷应激状态下novel-miR-133-5p的异常上调可能会对机体的生长发育、免疫调节和遗传等方面有重要的影响。     

miR-126-5p在沙子岭猪睾丸组织差异表达分析及功能预测

利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测miR-126-5p在沙子岭猪睾丸组织8个不同发育时期(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)表达量,以了解其在动物睾丸发育及精子生成中的作用。利用miRanda、TargetScan和mirWalk 3个数据库预测miR-126-5p靶基因并取交集,利用David在线软件分析miR-126-5p靶基因的生物功能。结果表明,miR-126-5p在胚胎期(E90-D1)睾丸组织中高表达,而在生长期(D1-D90)表达量下调,但在沙子岭猪性成熟(D120)后表达量又上调,其中D1表达量最高,D90表达量最低,且二者与其他7个时期均差异极显著(P0.01);D30、E90、D180相互之间差异不显著(P0.05),且分别与其余各时期差异极显著(P0.01);D120与D30差异显著(P0.05),与其余各时期差异极显著(P0.01);D150与D60之间差异不显著(P0.05),二者分别与其余各时期差异极显著(P0.01)。miR-126-5p靶基因参与细胞增殖、凋亡、分化、细胞通讯、迁移及蛋白质转运等生物学过程(P0.001);靶基因分子功能包括蛋白二聚体活性、配体依赖性核受体活性(P0.001);KEGG分析显示miR-126-5p靶基因参与TGF-β、MAPK、细胞黏附等信号通路(P0.01)。结合miR-126-5p在睾丸组织不同发育时期表达差异结果及其靶基因功能预测结果,miR-126-5p可能参与沙子岭猪生殖细胞分化及精子生成调控,本研究为miR-126-5p在动物精子生中的作用及其调控机制的研究提供依据。     

细毛羊皮肤毛囊miR-1298-5p的靶基因预测及验证

为探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,本实验以乾华肉用美利奴羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR和Western Blot对miR-1298-5p及其靶基因进行定量检测;扩增靶基因3'UTR区,构建野生型和突变型靶基因表达载体后与miR-1298-5p mimics共同转染到HEK293T/17细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1298-5p与靶基因的靶向关系。结果表明:FGF_2基因3'UTR区含有miR-1298-5p结合位点,FGF_2为miR-1298-5p潜在靶基因,通过核酸水平和蛋白水平定量表达规律发现miR-1298-5p与靶基因FGF_2呈负相关,初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1298-5p mimics能够抑制野生型FGF_2的靶位点报告载体的荧光素酶活性;但当靶基因结合位点突变后,FGF_2被抑制的荧光素酶活性能够得到恢复。综上,miR-1298-5p与FGF_2有靶向关系,miR-1298-5p能通过负调控FGF_2的表达调控羊毛囊发育。     

布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测与功能富集性分析

为进行布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测,本试验利用布鲁氏菌（Brucella）感染RAW264.7细胞后,分别运用miRanda和TargetScan软件进行差异表达的mmu-miR-671-5p靶基因的预测,预测的靶基因分别有11 953和9 252个,将预测结果取交集进行韦恩（Venn）分析,重叠部分的靶基因有3 681个;利用GO与KEGG进行功能富集性分析,再利用PicTar软件进一步对mmu-miR-671-5p的靶基因进行预测,将预测结果与Venn分析结果进一步取交集,结果显示,mmu-miR-671-5p的预测靶基因有7个;实时荧光定量PCR分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因相对表达量极显著降低（P<0.01）;在RAW264.7细胞中转染mmu-miR-671-5p inhibitors,分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;对mmu-miR-671-5p与Tnfrsf1b和Tnip1的3'非翻译区（3'UTR）结合靶位点分别进行预测,结果初步表明,mmu-miR-671-5p的靶基因为Tnfrsf1b与Tnip1,其预测结合靶位点均只有1个,分别位于Tnfrsf1b和Tnip1 3'UTR全长位置的91和305 bp。本研究结果为进一步揭示mmu-miR-671-5p在布鲁氏菌感染RAW264.7细胞过程中的功能提供科学依据。     

布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测与功能富集性分析

为进行布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测,本试验利用布鲁氏菌(Brucella)感染RAW264.7细胞后,分别运用miRanda和TargetScan软件进行差异表达的mmu-miR-671-5p靶基因的预测,预测的靶基因分别有11 953和9 252个,将预测结果取交集进行韦恩(Venn)分析,重叠部分的靶基因有3 681个;利用GO与KEGG进行功能富集性分析,再利用PicTar软件进一步对mmu-miR-671-5p的靶基因进行预测,将预测结果与Venn分析结果进一步取交集,结果显示,mmu-miR-671-5p的预测靶基因有7个;实时荧光定量PCR分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因相对表达量极显著降低(P0.01);在RAW264.7细胞中转染mmu-miR-671-5p inhibitors,分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因的相对表达量极显著升高(P0.01);对mmu-miR-671-5p与Tnfrsf1b和Tnip1的3′非翻译区(3′UTR)结合靶位点分别进行预测,结果初步表明,mmu-miR-671-5p的靶基因为Tnfrsf1b与Tnip1,其预测结合靶位点均只有1个,分别位于Tnfrsf1b和Tnip1 3′UTR全长位置的91和305 bp。本研究结果为进一步揭示mmu-miR-671-5p在布鲁氏菌感染RAW264.7细胞过程中的功能提供科学依据。     

辽宁绒山羊皮肤毛囊miR-1298-5p靶基因预测及验证

以辽宁绒山羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,用生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RTPCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因TGF-βR1进行核酸水平表达检测,利用Weston blot对潜在靶基因TGF-βR1进行蛋白水平表达检测。生物信息学预测结果表明TGF-βR1的3′UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点;miR-1298-5p在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达;TGF-βR1在皮肤毛囊不同发育时期无论在核酸水平还是蛋白水平均呈现差异性表达;miR-1298-5p与其潜在靶基因之间呈现一种负调控趋势,说明miR-1298-5p可能通过负调控TGF-βR1,从而对毛囊周期性发育起到调节作用。结合靶基因预测结果、miR-1298-5p在核酸水平表达规律及TGFβR1在核酸水平表达规律和蛋白水平表达规律初步确定TGF-βR1为miR-1298-5p的靶基因。本实验旨在探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5p与其靶基因的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为miR-1298-5p与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论研究数据。     

鸭瘟病毒的分子生物学研究进展

鸭瘟病毒属疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科。其核酸结构为线状双股 DNA,衣壳为二十面体对称 ,有囊膜。鸭瘟病毒的 DNA具典型的疱疹病毒 DNA的特征 ,大小约为 1 50 kb,两端为末端重复序列 ,中间有内部重复序列。囊膜蛋白为疱疹病毒的主要保护性抗原 ,它在介导病毒进入细胞 ,以及病毒的成熟与释放中均起重要的作用。疱疹病毒的囊膜蛋白主要有糖蛋白 B( Glycoprotein B,g B)、g C、g D、g E、g I等。其他蛋白如 Ul3 6、Ul3 7等在病毒的成熟与释放中也起重要的作用。国内外已有多人建立起鸭瘟的PCR检测方法 ,而其基因工程疫苗的研究报道较少。但参考其他疱疹病毒特别是伪狂犬病的基因工程疫苗的研究 ,可以推测鸭瘟的基因工程疫苗研究也大有可为。     

鸭病毒性肝炎病毒的分子生物学研究

鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis,DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）引起的雏鸭的一种高度致死、传播迅速、以肝炎为主要特征的病毒性疾病,临床主要表现为肝脏肿大和出血。发病的主要症状为：病初精神委顿,不能走动,食欲废绝,缩颈,嗜睡,有的出现腹泻,粪便稀薄带绿色。不久,病鸭便出现神经症状,不安,运动失调,身体倒向一侧,两腿痉挛,数小时后死亡。死前头向后仰,呈角弓反张姿势。     

鸭甲肝病毒的分子生物学研究进展

鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的重要传染病.近两年来,国内外对该病病原开展了分子生物学研究,本文描述了病原的血清型、分类地位、基因组结构、基因组变异性等方面的研究进展.     

microRNA let-7调控动物个体发育的研究进展

microRNA(miRNA)是一类广泛存在于多细胞动物中的进化保守的大小为18~25nt的非编码小分子RNA,可以通过与靶基因mRNA的非编码区(3′UTR)结合导致mRNA降解,或阻断mRNA翻译而调节基因表达。let-7是在线虫中发现的具有转录后调节功能的小分子RNA,具有高度的保守性,研究发现,let-7参与动物个体多个器官组织的发育过程。作者综述了近年来let-7参与调控脑、神经系统、心肺系统和肌肉发育等组织器官的研究成果,初步阐述了let-7调控组织器官发育的作用机制,以期为进一步探索let-7在动物体内的功能奠定基础。     

7个品种鸭MSTN基因5’-调控区单核苷酸多态性研究

为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)基因在鸭群体中的遗传变异情况,试验以莆田黑鸭、连城白鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、建昌鸭、高邮鸭及北京鸭为材料,采用连接酶检测反应(LDR)的方法对MSTN基因5’-调控区第1 024位点单核苷酸多态性(SNP)进行基因分析,并统计该位点在群体中的基因型频率、等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡情况。结果表明:在7个品种鸭中,检测MSTN基因第1 024位点均含CC、CG和GG 3种基因型。在连城白鸭、攸县麻鸭和高邮鸭中,CC基因型占优势,且以连城白鸭最高(0.72);在高邮鸭和建昌鸭中,CG基因型占优势;在北京鸭中,GG基因型占优势;在绍兴鸭中,CC基因型、CG基因型出现的频率相同。建昌鸭和北京鸭等位基因G的频率高于等位基因C的频率,其他品种鸭均为等位基因C的频率大于等位基因G的频率。莆田黑鸭、连城白鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、北京鸭和高邮鸭MSTN基因在第1 024位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),仅有建昌鸭不符合Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。     

鸭2型疱疹病毒的分子生物学依据

鸭2型疱疹病毒，是一种可侵害番鸭、半番鸭等不同品种鸭的疱疹病毒科新成员，经生物学特性测定、血清学试验及致病性试验表明该病毒不同于鸭瘟病毒。采用SDS-PAGE分析表明该病毒的结构蛋白带有14条，主要结构蛋白带有7条，其分子量分别为310、163、95、79、69、39、15KD，不同于鸭瘟病毒。依据鸭瘟病毒UL6基因的序列，设计了一对引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳表明只有鸭瘟病毒核酸提取物可扩增出大约420bp的DNA片段，而鸭2型疱疹病毒核酸提取物、鸡传染性喉气管炎病毒核酸提取物和正常细胞培养物均未扩增出目的基因片段，可见鸭2型疱疹病毒与鸭瘟病毒在DNA分子水平上也存在差异。本研究揭示了该病毒与鸭瘟病毒在结构蛋白和核酸水平上的差异，进一步表明该病毒不同于鸭瘟病毒，为该病毒的确切分类提供了分子生物学依据。     

细毛羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5p靶基因预测及验证

为了探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,以细毛羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因FGF_2进行核酸水平相对定量检测,利用Western Blot对潜在靶基因FGF_2进行蛋白相对定量检测。生物信息学预测结果表明,FGF_2的3'UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点;miR-1298-5p在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达;miR-1298-5p与其潜在靶基因之间呈现一种负调控趋势,说明miR-1298-5p可能通过负调控FGF_2从而调控皮肤毛囊生长发育。表明结合靶基因预测结果、miR-1298-5p在核酸水平表达规律及FGF_2在核酸水平表达规律和蛋白表达水平表达规律初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。     

靶向猪ATGL基因的miRNA预测及鉴定

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照,以pRL-TK载体作为内参,与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞,最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR,双荧光素酶报告基因试验显示sscmiR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性,而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明,sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。     

Lin28调控let-7 microRNA合成机制的研究进展

Lin28是在胚胎干细胞中广泛表达的RNA结合蛋白,参与分化、发育、肿瘤发生、葡萄糖代谢等多个生命过程。Lin28执行这些功能主要是通过抑制let-7 miRNA的生物合成,并且主要依赖Lin28氨基端冷休克结构域和羧基端锌指结构域。最近一些结构学研究揭示了Lin28调控let-7合成机制,Lin28结合在pri-let-7和pre-let-7的末端loop上,从而阻断Drosha和Dicer的加工,这些互作的特异性主要由锌指结构域和保守的GGAG模体介导。本文就Lin28如何通过其结构域与let-7miRNA前体特异性结合,特异性结合的结构基础等进行了综述,以期为相关研究提供借鉴。