禽沙门菌多重PCR检测方法的建立与应用

沙门菌是重要的人畜共患病原菌,血清型很多。不同种类、不同日龄的家禽均可感染,是严重危害养禽业的病原之一。本文通过血清学、分子生物学方法对上海部分鸡场的沙门菌进行了检测,与传统检测方法相比,缩短了检测时间,提高了检测的特异性和敏感性。实验结果发现禽伤寒/鸡白痢沙门菌、鸡肠炎沙门菌血清学为阳性的,经多重PCR鉴定,发现绝大部分不是禽源性沙门菌,由此可见,沙门菌多重PCR检测为临床诊断提供了一种快速、敏感和特异性高的诊断方法。     

沙门菌多重PCR检测方法的建立及其应用

为鉴定临床上常见的3种沙门菌血清型,针对特异性基因invA(沙门菌属)、sdfl(肠炎沙门菌)、Stm4495(鼠伤寒沙门菌)和SPUL-2693(鸡白痢沙门菌)设计引物,利用标准菌株通过优化体系成功建立了沙门菌的四重PCR检测方法.结果 显示:该方法特异性好,敏感性高(检测下限:基因组为500 pg/mL,菌液为10...     

鸡源致病性沙门菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测方法,设计3对特异性引物,第1对扩增沙门菌属特异性毒力基因invA 285bp片段,第2对引物扩增沙门菌鸡宿主特异性基因fliC 600bp片段,第3对引物扩增沙门菌质粒毒力基因spvR 507bp片段,经过对反应条件的优化,建立了检测鸡源致病性沙门菌的多重PCR方法。该方法可以特异扩增携带毒力质粒的致病性鸡沙门菌,而与大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌、痢疾志贺菌及普通变形杆菌均无交叉反应;对沙门菌菌液的检出下限为4.5×102 CFU/mL,对重组质粒标准品的检出下限为1.67×103拷贝/μL。应用所建立的方法对采集的223份临床疑似病料进行检测,结果检出invA基因阳性27份,占12.11%,其中invA+spvR基因阳性19份,占8.52%;invA+fliC基因阳性2份,占0.89%;invA+spvR+fliC基因阳性6份,占2.69%。表明所建立的多重PCR可用于鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测及流行病学调查。     

沙门菌PCR检测方法的建立

本实验根据沙门菌的侵袭性抗原保守基因肠毒素(STN)基因上的靶序列设计一对引物,对沙门菌基因组DNA进行PCR扩增,建立了沙门菌的PCR检测方法,与传统的细菌分离鉴定方法比较,该方法具有快速、特异、灵敏的特点,在沙门菌监测领域具有广阔的应用前景。     

3种禽支原体多重PCR检测方法的建立及应用

从鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和火鸡支原体 3种致病性支原体液体培养物中提取DNA,用特定引物分别和组合进行PCR,均得到了特异性扩增产物,片段大小分别为732、207和850 bp。直接用液体培养物进行PCR亦得到了一致的电泳条带。试验结果表明,建立的PCR方法可用于上述3种支原体临床感染的鉴别诊断。ELISA血清学检测和气管拭子PCR检测的比较结果表明,该PCR方法可用于临床MG检测。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立与应用

参照GenBank公布的鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌fimH基因序列,根据两者在第37和第544位碱基的不同,设计了一对等位基因特异性引物,建立了一种鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR(AS-PCR)检测方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床样品进行了检测.结果表明,该AS-PCR的扩增产物大小为543 bp,核酸检出限为12.6 pg/μL,菌液检出限为2.3×104 cfu/mL,适用于鸡泄殖腔拭子、鲜蛋、饲料和饮水中鸡白痢沙门菌的检测.该AS-PCR检测方法具有简便、快速、特异性强、敏感度高等特点,可应用于鸡白痢沙门菌的快速检测.     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank提供的沙门菌invA基因序列和志贺菌ipaH基因序列设计引物,建立了二重PCR方法,在同一反应体系同时检测两种致病菌核酸,经二重PCR方法扩增后,在同一泳道同时检出沙门菌284 bp和志贺菌611 bp特异性扩增条带,而普通大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、阪畸大肠埃希菌、绿脓杆菌、蜡样芽胞杆菌、马链球菌、产单核细胞李斯特菌、鹅大肠埃希菌、猪水肿病大肠埃希菌均未出现这两种条带.对PCR产物进行测序,测序结果与已发表的基因核苷酸序列比较,沙门菌同源性为93%～100%,志贺菌同源性为98%～100%.应用建立的沙门菌和志贺菌二重PCR方法对广西6个试验猴养殖场1 665份猴粪便样品进行检测,检出沙门菌阳性25份,志贺菌阳性90份,阳性检出率分别为1.5%和5.4%.表明建立的沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于临床粪便样品的快速检测.     

多重PCR技术对沙门菌毒力因子检测

为了检验多重PCR技术在沙门菌毒力鉴定中的临床应用效果,评价沙门菌在陕西关中地区的流行情况,从该地区多家养殖场分离获得19株细菌,分别利用生化试验与小鼠攻毒试验和多重PCR技术鉴定和检验了沙门菌及其毒力。结果表明,多重PCR技术对分离沙门菌的鉴定结果和生化试验鉴定结果一致,符合率达100%;毒力质粒携带情况与小鼠攻毒结果一致;同时鉴定出陕西省多家养殖场中存在携带毒力基因菌株,值得关注其对畜禽养殖的潜在威胁。多重PCR技术能够快速、简便、灵敏度高和特异性强的鉴定沙门菌,并可鉴定出其毒力,可以用于致病性沙门菌的流行病学检测,值得在兽医临床和畜产品沙门菌污染的检测中推广应用。     

禽源多杀性巴氏杆菌毒力基因多重PCR检测方法的建立

为建立多重PCR方法用于禽源多杀性巴氏杆菌中毒力基因的检测,对禽源多杀性巴氏杆菌分离株MD-1的9个毒力基因进行PCR扩增及敏感性测定,然后通过多个基因的组合得到5种多重PCR体系,并从中筛选合适的多重PCR体系,测定其特异性、敏感性和重复性。结果显示,分离株MD-1中的9个毒力基因均可扩增出目的片段,敏感性测定结果表明,有的基因可检测至1.81×10~4 copies/μL的核酸。筛选出的4种多重PCR体系1、3或4、5均可用于其中6个毒力基因(pfhA、nanB、ompH、oma87、sodA、sodC)的检测,并且特异性较强,均能够扩增禽源多杀性巴氏杆菌分离株HN-1和CZ-6,而大肠埃希菌和沙门菌分离株均无扩增条带。多重PCR体系1、3、4可检测多杀性巴氏杆菌核酸的敏感性为1.81×10~6 copies/μL,多重PCR体系5甚至可检测至1.81×10~5 copies/μL,同时这4种多重PCR体系与单个毒力基因PCR检测的敏感性均一致。说明建立的禽源多杀性巴氏杆菌毒力基因的多重PCR检测方法对多杀性巴氏杆菌毒力基因的快速检测有参考价值。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同，设计和合成了等位基因特异性PCR引物，建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法，并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示，该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌，检测灵敏度达100PgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定，鉴定出33株鸡白痢沙门菌，符合率为94．3％。表明，建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

肉品中肠毒素性大肠杆菌和肠沙门菌多重PCR检测方法的建立

利用肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的LT-A、ST-1毒素基因和肠沙门菌的iroB基因设计3对引物,建立能同时检测ETEC和肠沙门菌的多重PCR方法。结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,本方法的特异性为100%、灵敏度达10~10~2CFU/mL,用建立的多重PCR方法对30份临床可疑腹泻样品进行检测并与生化试验比较,结果两种方法检出大肠杆菌和沙门菌的阳性符合率达100%。     

禽沙门菌分离鉴定方法的建立与优化

本研究旨在建立和优化禽沙门菌分离鉴定的方法。选择山东省某地方品种鸡疑似发生沙门菌病的未出壳死胚样品24份,通过4组不同的培养基组合比较沙门菌的分离情况,选择沙门菌通用引物两对和鸡白痢特异性引物一对进行分离株的PCR检测,比较其特异性,然后进行血清分型和MLST分型,确定沙门菌类型并研究其相关性。结果表明,该批样品中TTB比SC增菌效果好,XLD和XLT4选择培养基对沙门菌分离效果相同,最终通过PCR方法鉴定出沙门菌阳性率为58.3%;发现两对通用引物特异性一致,表明可任选一对引物进行PCR鉴定;用鸡白痢沙门菌特异性引物完成的PCR鉴定结果显示,14株沙门菌中有7株为鸡白痢沙门菌;血清型鉴定结果表明,14株沙门菌中有7株鸡白痢沙门菌、7株肠炎沙门菌,共两种血清型;MLST分子分型结果表明,14株沙门菌分为3个ST型,分别是7株ST11、3株ST92和4株ST2151,其中ST11为肠炎沙门菌,ST92和ST2151为鸡白痢沙门菌;本研究表明,疑似沙门菌感染样品经BPW和TTB增菌、XLD或XLT4选择培养基分离培养,最后通过PCR方法可准确完成沙门菌的分离鉴定;同时,应用该方法可完成对鸡白痢沙门菌的鉴定,并与血清分型和MLST分子分型结果一致。     

布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 bp片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法从布鲁菌标准菌株中扩增出了特异性的目的片段,而对大肠埃希菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀释的模板进行检测,多重PCR的敏感度为最低可检出1.1×10-3ng的DNA,在感染布鲁菌病奶牛乳汁模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/mL。不同人员用该方法重复检测,结果均一致,表明重复性好。应用该方法对88份临床疑似布鲁菌感染的奶牛乳样进行了检测,结果检出17份阳性,阳性检出率约为19.3%。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁菌病的临床检测及流行病学监测等。     

禽源沙门菌gyrA基因多态性的检测与分析

沙门菌是常见的人畜共患病原菌,不仅能导致鸡白痢、禽伤寒和禽类副伤寒等疾病,而且是人类伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎等疾病的病原菌[1].抗生素的应用,对预防和控制沙门菌病发挥了巨大的作用,但是随之产生了耐药性的问题.     

沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用

建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-time PCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO_4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μL Bst 2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×10~2 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍,与real-time PCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×10~2 CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。     

鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立一种快速、高效和简便的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法,根据沙门菌侵袭蛋白基因invA的高度保守区域,利用Primmer 5.0软件设计2对特异性的套式引物,以提取的沙门菌DNA为模板克隆invA基因,将其连入T载体并计算拷贝数作为套式PCR的模板,在对反应条件进行优化的基础上,建立最佳的套式PCR反应条件,确定其上、下游引物用量分别为0.3μL,套式PCR的第1次退火温度为57.4℃,第2次为53.5℃。应用该方法对已构建好的不同浓度的标准阳性质粒作为模板进行检测,其灵敏度为102拷贝数/20μL,远高于常规PCR的106拷贝数/20μL。用建立的套式PCR方法对从新疆石河子某鸡场采集的25样品进行检测,与传统的诊断方法比较符合率达95.00%。建立的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法具有快速、可行、特异性强、准确率高等特点,为鸡沙门菌病的早期诊断和研究提供了技术支撑。     

水产品中沙门菌PCR检测技术建立及应用研究

为了对北京市场上水产品中沙门菌情况进行检测,试验利用PCR方法获得沙门菌特异性引物对北京市场的水产品进行检测。结果表明:有2个样品发现了目的条带,通过测序说明其携带沙门菌。     

沙门菌LAMP检测方法的建立

为动物产品沙门菌快速检测提供技术支持,针对沙门菌属特异性的侵袭蛋白(Invasion protein,invA)基因设计2对引物,建立了一种环介导等温扩增(Loop-mediated iso?thermal amplification,LAMP)方法。对优化后的LAMP方法进行了特异性检测、灵敏度检测及沙门菌人工污染鸡蛋内容物检测。结果表明,该LAMP法可快速、特异地检测出沙门菌。LAMP法对细菌培养物检出限为8.7×100cfu/mL,对人工污染鸡蛋内容物中沙门菌的检出限为9.5×100cfu/mL。该方法有望用于鸡蛋中沙门菌的快速检测。     

沙门菌LAMP检测方法的建立

建立了一种沙门菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。依据GenBank公布的沙门菌属fimY基因序列,利用Primer Explorer V5软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法,并对其特异性和敏感性进行了评价。结果表明,针对fimY基因建立的LAMP方法具有较强的特异性,最低可检出浓度为56×102CFU/mL,灵敏度高于PCR方法 10倍。