禽弱毒疫苗中REV低剂量污染检测方法的比较

使用污染有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的弱毒疫苗是REV感染途径之一,而通常弱毒疫苗中REV的污染剂量较低,难以检测,本研究对不同方法在检测弱毒疫苗中REV低剂量污染进行了比较研究。将定量好的REV以不同剂量分别人为污染一批商品化新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗,提取核酸后分别以TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测、常规RT-PCR检测以及PCR产物结合核酸斑点杂交检测等不同方法进行检测。结果显示常规RTPCR检测仅可检测到10TCID50/羽份的REV污染,而另外两种方法均检测到1TCID50/羽份的低剂量REV污染。将人为污染1TCID50/羽份和2TCID50/羽份REV的NDV弱毒疫苗各接种10只SPF鸡,定期针对REV抗体及其核酸进行检测,结果显示在免疫污染疫苗后7周内REV抗体全部为阴性,而核酸检测均可以检测到一定比例的阳性,提示通过接种SPF鸡检测弱毒疫苗中REV污染时,仅仅通过抗体判定可能会对一些剂量较低的REV污染造成漏检,通过结合对病原的检测有助于降低漏检率。     

经鸡胚感染的ALV-J对新城疫弱毒疫苗免疫的抑制作用及疫苗株对病毒载量的影响

为了解经鸡胚感染携带J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的雏鸡体内ALV-J对新城疫(ND)弱毒疫苗(La Sota株)免疫的抑制作用以及疫苗免疫后增强ALV-J对雏鸡致病作用的可能性,随机选择50个SPF鸡胚经卵黄囊接种模拟ALV-J感染,同时选取等量SPF鸡胚以相同方式接种PBS作为对照。出雏后于接毒组和对照组各取20只SPF鸡在7日龄时免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)。2～6周龄时,记录各组鸡的体重和免疫器官指数,并对雏鸡的NDV抗体水平和血液ALV-J病毒载量进行动态检测。结果显示,感染ALV-J的SPF鸡5、6周龄时体重显著低于PBS对照组(P0.05),而感染ALV-J再免疫新城疫弱毒疫苗后SPF鸡体重进一步降低(P0.05);与PBS对照组相比,6周龄时感染ALV-J的SPF雏鸡胸腺萎缩和脾脏肿大(P0.05),免疫新城疫弱毒疫苗后胸腺和脾脏损伤加剧(P0.05);3、4周龄时感染ALV-J再免疫ND弱毒疫苗组的雏鸡NDV抗体水平极显著低于仅免疫ND弱毒疫苗组(P0.01);4周龄时免疫弱毒疫苗后的SPF鸡血液中ALV-J病毒载量高于未免疫组(P0.01)。研究表明,感染ALV-J的雏鸡在免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)后增强了ALV-J对SPF雏鸡的致病作用,提示净化种源的重要性。     

新城疫F－Ⅶ型－－鹅源禽副粘病毒灭活疫苗的研制与免疫效力试验

用GPV-SF02株作为抗原液,经福尔马林灭活后,与油佐剂混合,制成SF02灭活疫苗。同时将ND灭活疫苗、ND弱毒疫苗和SF02灭活疫苗按不同剂量分别免疫川白鹅和AA鸡,结果用1羽份SF02灭活疫苗免疫的鹅与鸡,能100%抵抗SF02株和F48E9株的攻击;用1羽份ND灭活疫苗免疫的鸡能100%抵抗F48E9株的攻击,而免疫的鹅对F48E9株的抵抗力为60~80%;用1羽份ND弱毒疫苗免疫的鹅,其保护率在0~50%,免疫的鸡则有100%的保护率。     

重组新城疫病毒HN与F蛋白免疫保护作用的初步研究

95只1日龄SPF鸡随机分成5组,1～4组分别于10日龄接种φT4、φT4-Z1-HN、φT4-Z1-F、φT4-Z1-HN φT4-Z1-F油乳剂疫苗,第5组接种ND弱毒疫苗,25日龄加强免疫一次.结果表明,重组HN和F蛋白均能诱导ND抗体产生,但抗体水平显著低于用弱毒疫苗免疫的第5组.60日龄时用100LD50NDV强毒株攻毒,第1组鸡100%发病和死亡,φT4-Z1-HN和φT4-Z1-F免疫组的死亡率分别为50%和15.8%;用φT4-Z1-HN φT4-Z1-F和ND弱毒疫苗免疫的第4、5组鸡无一死亡.     

猪脾转移因子增强禽白血病病毒A/B亚群抗体阳性鸡群免疫水平的研究

为了解猪脾转移因子(TF)对禽白血病病毒A/B亚群(ALV—A/B)抗体阳性鸡群免疫水平的影响,本研究以新城疫(ND)HI试验和淋巴细胞增殖试验分别检测ND HI抗体效价(log2x)和刺激指数(SI)作为指示参数,采集特佳、罗曼、海兰和伊莎共4个品种蛋鸡血样,并从中选出各60羽份(ALV-A/B抗体阳性、阴性鸡各半,ALV p27抗原均为阴性),将4个品种的ALV-A/B抗体阳性蛋鸡均分为实验组(联合接种TF 0.02 mL+NDV La Sota疫苗1羽份/羽,TF多肽含量为3.5 mg/mL,核糖含量为72.0μg/mL,脱E受体法效力检验活力为15%)和对照组(单独接种NDV La Sota疫苗1羽份/羽),于接种后21 d采血检测。结果显示,ALV-A/B抗体阳性鸡群(120羽份)的ND HI抗体效价均值(6.1±1.3)与阴性鸡群(120羽份)均值(6.2±1.3)差异不显著,但其SI均值(1.20±0.10)显著低于阴性鸡群(1.35±0.10)(p0.05);实验组(60羽份)的ND HI抗体效价和SI均值(9.0±1.3,1.73±0.15)显著高于对照组(60羽份)均值(7.8±1.2,1.39±0.16)(p0.05)。研究结果表明,ALV-A/B抗体阳性与鸡ND HI抗体效价相关性不大,而对SI具有抑制作用;TF具有增强ALV-A/B抗体阳性鸡群免疫水平的作用。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ法荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中可能存在的鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)污染,根据CIAV基因组保守区域VP2部分基因设计和合成了1对特异性引物,通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示,建立的检测方法灵敏度可达6.36 copies/μL,是常规PCR灵敏度的1000倍。该方法与禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)、鸡马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)等均无交叉反应,特异性良好;批内和批间重复试验显示变异系数均小于2.5%,呈现良好的可重复性。在模拟试验中,建立的SYBR Green I荧光定量PCR能够检测到1000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染,应用该方法从送检的14种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性,阳性样品按照经典的SPF鸡检查法进行检测也为CIAV阳性。因此,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,适合用于疫苗中CIAV污染的检验。     

检测鸡球虫四价弱毒疫苗抗体应答的ELISA方法的建立及初步应用

本研究旨在建立检测鸡球虫四价弱毒疫苗(柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫)抗体应答的酶联免疫吸附试验(ELISA),并初步阐明鸡免疫四价弱毒疫苗及攻虫后的抗体应答。将300羽岭南黄鸡分为A(免疫攻虫组)、B(不免疫不攻虫组)、C(不免疫攻虫组)共3个组。A组雏鸡在4日龄时进行首免,11日龄时鸡开始二免,二免完成后(17日龄时)对A组及C组的鸡进行攻虫(28万个4种球虫的混合卵囊/羽),7 d后检查A、C两组鸡的存活率。在鸡二免和三免完成后,分别对A、B组进行采血,通过优化最佳抗原包被浓度、酶结合物工作浓度及最佳血清稀释度,建立了ELISA方法来检测鸡体对球虫四价弱毒疫苗的抗体应答情况。A组鸡血清抗体的平均D值为0.870和0.904,明显高于B组鸡的平均D值0.261和0.270,证明了鸡体免疫疫苗后可以刺激产生相应抗体。免疫鸡攻虫后的存活率和抗体应答的检测结果,都充分说明了此鸡球虫弱毒四价疫苗具有良好的免疫原性,所建立的ELISA方法为今后评价鸡球虫弱毒四价疫苗的免疫效力提供了有效手段。     

鸡传染性法氏囊病活疫苗免疫效果评估

本试验选用A、B、C、D 4种商品化鸡传染性法氏囊病活疫苗免疫SPF鸡,进行攻毒试验以评估不同疫苗的免疫效果。10日龄SPF鸡分组后分别用A、B、C、D 4种商品化法氏囊病活疫苗按1羽份/只剂量接种免疫,21日龄时用1000 LD₅₀剂量的法氏囊超强毒株(GD0104)进行攻毒,各组疫苗的保护率分别为100%、85%、100%、100%;35日龄时用1000 LD₅₀剂量的法氏囊超强毒株(GD0104)进行攻毒,各组疫苗的保护率分别为100%、75%、95%、100%。免疫后抗体检测显示,抗体滴度水平D＞A＞C＞B,抗体转阳速度A＞D＞C＞B,免疫应激作用A、D＞B、C。综合考虑疫苗免疫攻毒后各项指标的变化,A、D疫苗免疫效果优于其他两种活疫苗,可以有效地为SPF鸡提供保护作用。     

SPF鸡感染禽白血病病毒A/B亚群后血清抗体与卵黄抗体的变化及其相关性

拟研究以卵黄抗体替代血清抗体检测判定SPF鸡群禽白血病病毒(ALV)感染状态的可行性。在人工接种ALV-A/B后的40只SPF鸡刚开产时,从21只抗体阳性鸡及19只抗体阴性鸡分别采集血清和卵黄并一一对应,比较卵黄不同稀释度与血清中ALV-Ab抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。另外36只同批次不攻毒的SPF鸡单独饲养作为对照,76只鸡在25~34周龄期间,每隔3周分别采集1次血清,每周采集1次种蛋,共采集了304份血清样品及836份卵黄样品。所有血清和卵黄抗体用IDEXX的ALV-Ab抗体ELISA检测试剂盒检测。血清按试剂盒规定的1∶500稀释,卵黄按预试验结果选定稀释度稀释。同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品,严格在同一次ELISA试验中检测。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄做1∶300稀释时,假阳性和假阴性最少,确定1∶300为卵黄最适稀释度。在25~34周龄,836份卵黄抗体的检测判定结果与304份血清抗体检测结果吻合率达94.7%,即这些血清抗体阳性鸡同时期采集的卵黄抗体也全部阳性,血清阴性鸡的卵黄抗体也均为阴性。结果提示疫苗生产企业可通过检测SPF种蛋的卵黄抗体来判断SPF鸡场对ALV的洁净度。     

鸡新城疫疫苗对鹅副粘病毒病免疫效果观察

本研究利用几种常规鸡新城疫（ND）疫苗进行了鹅副粘病毒病的免疫效果试验。240只20日龄ND抗体检测阴性的小鹅分为8组,每组30只。第1～3组鹅用2～5羽份（相对于鸡,下同）Ⅳ系苗首免,2周后用2或5羽份NDI系疫苗二免;第5和6组鹅用2羽份禽流感．鸡新城疫（AI-ND）二联活疫苗（rL-H5株）首免,3周后再用2或5羽份同种疫苗二免;第4和7组鹅分别用2羽份灭活油乳剂苗和2羽份Ⅳ系疫苗单免;第8组鹅为非免疫对照组。定期采血检测各组NDHI抗体水平,分别于单免或二免后第21d和140d每组抽5只鹅用鹅源副粘病毒强毒株JG97进行攻毒试验,攻毒剂量为400LD50/只。试验结果表明,第1～3组鹅免疫后产生的抗体水平较高,免疫保护期也较长。到二免后140d,这三组鹅的平均HI抗体水平仍维持在4log2矿左右,而且可完全抵抗强毒攻击。根据实验结果,建议生产上采用2羽份NDIV系苗首免、2周～3周后以2～5羽份NDI系苗二免的免疫程序预防鹅副粘病毒病。     

禽白血病病毒对禽流感疫苗免疫效果的影响

为研究禽白血病病毒(ALV)对禽流感(AI)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔接种ALV HLJ09DH02株后,于21日龄免疫重组禽流感病毒(AIV)灭活疫苗(H5N1亚型,Re-8)或禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-8),免疫后与未感染ALV的免疫对照鸡同时检测血清HI抗体并采用H5N1亚型高致病性AIV攻毒。结果显示:实验鸡感染ALV后HI抗体滴度均显著低于相应的未感染ALV的免疫对照组(p0.05)。感染ALV后,免疫Re-8灭活疫苗及其对照组攻毒后的排毒鸡数分别为4/10和0/10,存活率分别为90%和100%;感染ALV后,免疫r LH5-8活疫苗及其对照组攻毒后的排毒鸡数分别为10/10和0/10,存活率分别为0和100%;未感染ALV的AI免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒;空白对照鸡攻毒后3 d内全部死亡并且排毒。本研究表明,ALV对AI灭活疫苗和活疫苗均具有显著免疫抑制作用,建议加强种鸡ALV的净化,降低对AI等疫苗免疫效果的影响。     

鸡传染性法氏囊疫苗毒对禽脑脊髓炎油乳剂灭活苗免疫效果的影响

21日龄SPF鸡接种法氏囊中等弱毒疫苗A株后,用禽脑脊髓炎油乳剂灭活苗进行免疫,观察法氏囊疫苗毒对禽脑脊髓炎油乳剂灭活苗免疫效果的影响,用ELISA检测禽脑脊髓炎病毒抗体滴度,结果表明试验组血清抗体水平明显下降,其阳性率与对照组比较存在显著差异,说明法氏囊中等弱毒疫苗A株能造成机体免疫抑制,引起禽脑脊髓炎抗体水平下降。     

马立克病毒感染对鸡体液免疫的影响

为了验证和探讨马立克病毒(MDV)对肉鸡的免疫抑制作用,同时对比研究MDV疫苗和强毒株对机体免疫力的影响,试验通过人工攻毒MDV,建立MD模型,各组SPF鸡于2日龄注射NDV+H9N2 AIV灭活苗,7日龄时以LaSota株NDV弱毒疫苗饮水免疫,在SPF鸡14,21,28,35,42日龄时,各组无菌采血25份,分离血清,利用血凝/血凝抑制试验研究各组ND和H9N2的体液抗体水平。结果表明:在整个试验周期,疫苗对照组和空白对照组NDV和H9N2 AIV抗体水平差异不显著;攻毒组SPF鸡在21~42日龄时,NDV和H9N2 AIV抗体水平显著或极显著低于对照组。     

甘保罗病弱毒疫苗对法氏囊及新城疫HI抗体滴度的影响

我场于1999年10～12月进行了甘保罗病(传染性法氏囊病，IBD)弱毒冻干疫苗免疫后对法氏囊及新城疫HI抗体滴度影响试验，结果如下。一、试验鸡及疫苗：1天龄雏鸡200羽，试验组及对照组各100羽雏鸡，饲料由我场饲料场提供。疫苗为英特威公司的IBD D－78冻干弱毒疫苗。其他免疫如新城疫、鸡痘、传支等免疫疫苗均由英特威公司提供。免疫程序为：4天龄时传支＋新城疫疫苗点眼；7天龄时鸡痘疫苗刺种；14天龄时新城疫弱毒疫苗点眼，新城疫油乳剂灭活疫苗1／2羽份胸肌注射；17天龄时IBD弱毒疫苗滴鼻。二、IBD冻干疫苗免疫后对法氏囊重量影响IB…     

不同IBD疫苗免疫后对新城疫疫苗免疫的影响

用 5种传染性法氏囊病 (IBD)商品疫苗和 1种中试产品 (NF8株 )免疫 7日龄SPF雏鸡和有IBD、新城疫 (ND)母源抗体的雏鸡。 1周后免疫新城疫ND疫苗 ,随后每周测定NDHI效价。在SPF鸡上的试验表明 ,5种IBD商品疫苗有 2种对ND免疫产生显著的持续的免疫抑制作用。在有IBD、ND母源抗体鸡上的试验表明 ,5种商品疫苗中仅有 1种对ND免疫产生 过性免疫抑制作用。NF8疫苗在SPF鸡及有IBD母源抗体鸡上对ND免疫均未产生明显的免疫抑制作用     

PCR法检测活毒疫苗中禽白血病病毒污染

为调查活毒疫苗中禽白血病病毒(ALV)污染情况,随机抽取安徽省鸡群使用的国内外公司(国内7家、国外1家)活毒疫苗(5个品种),先针对ALV各亚群保守的pol基因设计一对引物进行PCR检测,进一步针对env基因设计2对特异性引物,进行ALV J亚型和A^E亚型PCR检测。pol基因结果为鸡传染性囊病病毒(IBDV)B87株国内7个公司为阳性,鸡痘(AP)、鸡传染性喉气管炎(ILT)某国外公司为阳性,鸡新城疫(ND)LaSota株国内某公司为阳性。env基因结果为IBDV-B87株(国内某公司)和AP为J亚型阳性,ILT、ND-LaSota株和IBDV-B87株(国内另6个公司)为AE亚型PCR检测。pol基因结果为鸡传染性囊病病毒(IBDV)B87株国内7个公司为阳性,鸡痘(AP)、鸡传染性喉气管炎(ILT)某国外公司为阳性,鸡新城疫(ND)LaSota株国内某公司为阳性。env基因结果为IBDV-B87株(国内某公司)和AP为J亚型阳性,ILT、ND-LaSota株和IBDV-B87株(国内另6个公司)为A^E亚型阳性。本研究共检测疫苗120份,ALV检出率达28.57%。因此,使用PCR法可作为活毒疫苗中ALV污染检测的有效方法,同时可以进一步鉴定污染的ALV是J亚型或AE亚型阳性。本研究共检测疫苗120份,ALV检出率达28.57%。因此,使用PCR法可作为活毒疫苗中ALV污染检测的有效方法,同时可以进一步鉴定污染的ALV是J亚型或A^E亚型。     

黄芪多糖、淫羊藿多糖对鸡新城疫疫苗免疫增强作用的研究

60羽14日龄罗曼雏鸡随机分成三组,每组20羽。对照组颈部皮下注射用生理盐水稀释的ND—Lasota弱毒冻干苗0．2mL／羽,试验I组颈部皮下注射用10％黄芪多糖(APS)溶液稀释的ND—Lasota弱毒冻干苗0．2mL／羽,试验Ⅱ组颈部皮下注射用10％淫羊藿多糖(EPS)溶液稀释的ND—Lasota弱毒冻干苗0．2mL／羽。分别于免疫后第10、20、30、40天采血测定ND血凝抑制(HI)抗体。结果表明,试验用药鸡血清中HI抗体效价比对照鸡明显提高,而且雏持时间延长。此外,T淋巴细胞ANAE阳性率与HI抗体效价有相应的消长趋势。由此可见,黄芪多糖、淫羊藿多糖对鸡新城疫疫苗者明显的免疫增强作用。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强株VP2基因重组新城疫病毒胚胎免疫安全性及效力试验

为研制能够同时预防传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)的疫苗,本研究选用表达IBD病毒(IBDV)超强毒株(vvIBDV)VP2基因的重组ND病毒(NDV)LaSota疫苗株(rL-VP2),测定其半数鸡胚感染量、平均鸡胚致死时间、脑内接种指数和静脉内致病指数等指标,按不同剂量接种18胚龄SPF鸡胚,分别于出雏后第9d、第14d和第21d采血,用微量凝集法和ELISA方法测定血清中抗NDV抗体和抗IBDV抗体水平,并于出雏后28d用NDV强毒(F48E9株)和vvIBDVGx株攻毒,评估重组疫苗的胚胎免疫效果。结果显示:按104EID50/枚剂量进行免疫不会影响SPF鸡胚出雏率和出雏后21d存活率,并且该免疫组雏鸡能够对NDV强毒和vvIBDV攻毒提供安全的免疫保护。     

NDVLaSota、V4疫苗免疫鸡及免疫攻毒鸡的主要特异性血清抗体动态变化规律比较

本研究应用间接ELISA方法对新城疫LaSota和V4疫苗免疫SPF鸡及免疫后攻毒SPF鸡的血清中新城疫病毒（NDV）特异性HI抗体、IgM和IgG抗体水平的动态变化进行了检测。结果表明，V4较LaSota疫苗免疫鸡HI抗体提前3天左右出现，但除高峰期（1周左右）外，其HI抗体水平均低于LaSota免疫鸡。LaSota免疫鸡。LaSota疫羁免疫鸡血清中NDV特异性IgM和IgGr抗体高峰较V4免疫鸡提前约2周出现，攻毒后，LaSota免疫鸡血清中特异性IgG和IgG回忆应答显著，而V4免疫鸡IgM和IgG回忆应答不明显。     

禽白血病病毒感染对新城疫和禽流感疫苗免疫效果的影响

为研究禽白血病病毒(ALV)感染对新城疫(ND)和禽流感(AI)疫苗免疫效果的影响,采用ELISA方法对河南省某地方品种鸡场进行ALV-p27抗原检测,同时采集试验鸡的血清样品,检测ND、AI(H_9)和AI(H_5)亚型的免疫抗体水平,并比较了ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡和后期感染对ND、AI疫苗免疫效果影响的差异。结果表明,ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡,能显著降低ND、AI(H_9)和AI(H_5)疫苗免疫的抗体水平,阳性试验组与阴性组相比血清中ND、H_9、H_5(Re-6)、H_5(Re-7)和H_5(Re-8)抗体效价分别降低1.71log2、2.37log2、1.59log2、1.00log2和1.79log2;鸡群后期感染ALV,对ND和AI疫苗的免疫没有明显的抑制作用,阳性试验组与阴性组相比无显著差异。