爬山虎乙醇提取物抗IBV的机制研究

为了明确爬山虎乙醇提取物的抗禽传染性支气管炎病毒(IBV)的作用机制,试验采用在IBV感染H1299细胞前24 h、感染细胞过程中、感染细胞1.5 h后,三个不同的时段往细胞培养液中加入一定量的爬山虎乙醇提取物,待感染24 h后,检测病毒增殖量。结果表明:爬山虎乙醇提取物在病毒感染细胞过程中和感染细胞1.5 h后加入,IBV增殖受到明显抑制,比值差异数量级均为2。说明爬山虎乙醇提取物能直接作用于病毒,并且爬山虎乙醇提取物在病毒感染细胞后再加入,病毒增殖也受阻,有明显的治疗作用。     

抗传染性支气管炎病毒的植物乙醇提取物筛选

为筛选出抗传染性支气管炎病毒(IBV)效果较好的植物,试验采用嵌合荧光素酶基因的IBV-3ab-luc为供试毒株,以人类肺癌细胞H1299为供试细胞,在升麻、丹皮、千里光、续断、元胡、龙葵6种植物乙醇提取物处理H1299细胞之前、中、后的一定时间感染,24 h后通过检测荧光素酶值,研究不同植物乙醇提取物的抗病毒机制。结果显示:丹皮的对数值为3,千里光的对数值为2,龙葵的对数值为1,升麻、续断和元胡的对数值为0。说明丹皮乙醇提取物抗IBV活性最强,其次是千里光,龙葵较差,而升麻、续断和元胡几乎没有抑制效果。     

黄芩抑制鸡传染性支气管炎病毒增殖的作用机制研究

为研究黄芩乙醇提取物对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的体外抑制作用及对IBV感染细胞内抗病毒基因表达的影响,进行以下试验:①以人肺癌H1299细胞为供试细胞,在IBV感染过程中在细胞培养体系中加入一定量的黄芩乙醇提取物,24 h后检测病毒增殖量;②将黄芩乙醇提取物稀释成4个不同浓度,观察不同浓度的提取物对IBV的抑制作用;③用RT-PCR检测黄芩乙醇提取物对IBV感染细胞内抗病毒基因OASL、IFI27、STAT1表达的影响。结果显示:黄芩乙醇提取物对IBV具有明显的抑制作用,且药物浓度越高抑制作用越明显;此外,黄芩乙醇提取物可增加IBV感染细胞内抗病毒基因的表达量。     

抑制IBV增殖的植物乙醇提取物的初步筛选

为了研究不同植物乙醇提取物抗传染性支气管炎病毒(IBV)的效果,试验采用将一定量的植物乙醇提取物和嵌合了荧光素酶基因的重组病毒IBV-3ab-luc室温混合20 min后,一同加入H1299细胞培养体系中,24 h后检测荧光素酶的活力,比较不同植物乙醇提取物对病毒的抑制作用。结果表明:三七叶的对数值为4,夏枯草干粉和车前子叶为3,麦冬为2,枸杞和桔皮为0。说明三七叶乙醇提取物抑制IBV的效果最好,其次是夏枯草干粉和车前子叶,较差的是麦冬,而枸杞果实和桔皮几乎没有抑制效果。     

植物乙醇浸提物抗传染性支气管炎病毒活性检测及其机制初探

为明确刀豆、皂荚和蛇麻子植物乙醇浸提物抗传染性支气管炎病毒(IBV)的作用机制,试验以嵌合荧光素酶基因的病毒株IBV-3ab-luc为供试病毒,在感染人类肺癌H1299细胞2 h后,用刀豆、皂荚和蛇麻子乙醇浸提物处理细胞,24 h后检测荧光素值,同时利用RT-PCR分析刀豆、皂荚和蛇麻子对干扰素的调控作用,研究其抗病毒机制。结果表明:皂荚和蛇麻子乙醇浸提物对病毒复制均有不同程度的抑制作用,其中,蛇麻子乙醇浸提物的抑制作用最强,皂荚的作用次之,而刀豆乙醇浸提物无显著效果;另蛇麻子和皂荚乙醇浸提物可增强β干扰素RNA的转录水平。     

蓬莪术乙醇提取物的抗IBV作用研究

为研究蓬莪术乙醇提取物对禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的体外抑制作用以及对抗病毒基因表达量的影响。本研究利用3种不同的加药方式处理H1299细胞,收集细胞进行荧光素酶的测定,同时利用实时定量RT-PCR方法进行IBV-N、IFN-γ和STAT1细胞因子表达量的定量。荧光素酶测定实验结果表明,在3种处理方式中,病毒加药组的荧光值均小于病毒对照组荧光值;RT- qPCR实验结果显示,STAT1在病毒加药组中的表达量低于病毒对照组。证实蓬莪术乙醇提取物抑制IBV在H1299中的复制并影响STAT1的表达量。     

猪流行性腹泻病毒诱导Vero E6细胞凋亡的动态研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞产生病变及细胞凋亡的动态变化,本研究应用western blot、间接免疫荧光、细胞活性计数(CCK-8)等方法检测PEDV感染Vero E6细胞后不同时间点细胞内病毒含量、细胞活性、凋亡小体的形成,以及相关凋亡因子的变化。结果表明,感染后24 h细胞内病毒含量开始明显升高,48 h时达到峰值。同时在病毒感染24 h后出现明显的细胞病变,感染48 h后出现典型的凋亡特征,细胞聚堆,细胞核内染色质固缩,形成凋亡小体。CCK-8分析检测结果显示,与对照组相比感染病毒细胞活性明显降低。另外,western blot结果表明促凋亡因子蛋白水解酶Caspase-3在病毒感染过程中被活化。该研究结果进一步证实了PEDV感染可以诱导细胞凋亡,其中Caspase-3的激活在病毒诱导细胞凋亡的过程中发挥重要作用。     

H3N2亚型猫流感病毒抑制Ⅰ型干扰素机制分析

家猫对高致病性和低致病性禽流感病毒(AIV)均易感,感染后可以导致肺炎的发生,而其易感机制无相关报道。本研究利用H3N2亚型AIV家猫分离株(FIV)为模型,分析了感染后对IFN-β应答的影响及机制。结果显示H3N2 FIV可以很好的在猫肾细胞(CRFK)上复制并导致明显的细胞病变(CPE),在感染48h后病毒滴度达104±0.25TCID50/mL;通过荧光素酶报告系统发现该病毒感染后不能激活IFN-β应答,反而能够抑制SeV介导的IFN-β通路激活。机制分析发现病毒能够抑制IRF3通路进而阻断IFN-β应答。本研究首次发现猫源H3N2亚型AIV能够抑制Ⅰ型干扰素应答,为理解H3N2亚型AIV如何跨种感染家猫提供了科学参考     

麦角甾醇过氧化物抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制试验

为了研究麦角甾醇过氧化物(ergosterol peroxide,PE)抑制PRRSV的活性,在体外用猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a毒株感染Marc-145细胞,在病毒感染的同时加入不同浓度的PE,24 h后固定细胞用间接免疫荧光检测细胞内的病毒N蛋白,同时收集细胞培养上清检测病毒滴度,结果显示,PE可剂量依赖性地抑制PRRSV在细胞中复制。分别用PE预处理病毒或细胞,结果发现,病毒与PE共孵育并不会抑制病毒感染细胞活性,而PE预处理细胞则会抑制病毒在细胞中复制。表明PE通过作用于宿主细胞而抑制PRRSV在体外细胞中复制,为进一步开发利用PE提供了基础。     

硫酸化茯苓多糖对PRRSV体外感染Marc-145细胞作用的影响

用稀碱法从茯苓中提取茯苓多糖,应用氯磺酸-吡啶法得到硫酸化茯苓多糖。通过观察细胞病变(CPE)效应来评价不同浓度硫酸化茯苓多糖和不同作用方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞的影响。结果表明,硫酸酯化茯苓多糖预作用于单层细胞12 h后感染104TCID50PRRSV,能明显阻断病毒感染细胞,其阻断病毒感染作用的最小浓度为100 mg/L;而硫酸化茯苓多糖预作用4 h后感染104TCID50的PRRSV阻断感染作用不明显,显示硫酸化茯苓多糖体外对PRRSV感染细胞的阻断感染作用呈一定的浓度和时间依赖性。感染剂量为104TCID50PRRSV后加入不同浓度硫酸化茯苓多糖,也能有效抑制病毒在细胞上的感染与增殖,其作用最小浓度为50 mg/L;而不同浓度多糖与104TCID50病毒在体外共同孵育12 h后加入到单层细胞,多糖直接杀灭PRRSV的最小浓度为100 mg/L。     

7种中药成分对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响

将氧化苦参碱、甘草酸、黄芪多糖、栀子苷、绿原酸、虎杖苷和木犀草素等7种中药成分稀释成安全浓度范围内的高、中、低3种浓度,分别与NDV以3种方式加入到培养成单层的CEF的培养体系中,用MTT法测定NDV感染细胞能力的变化.结果表明,先加中药后加病毒时,氧化苦参碱、甘草酸、黄芪多糖的高、中浓度、栀子苷高浓度显著抑制病毒感染细胞;先加病毒后加中药时,氧化苦参碱的高、中浓度、黄芪多糖的中、低浓度显著抑制病毒感染细胞;中药与病毒同时加入时,氧化苦参碱的高、中浓度,黄芪多糖的高、中、低浓度和甘草酸高浓度显著抑制病毒感染细胞.绿原酸、虎杖苷和木犀草素3种中药成分无论是哪种加药方式均无抑制NDV感染细胞的作用.     

猪瘟病毒诱导细胞自噬有利于病毒复制

首先采用蛋白印迹以及激光共聚焦显微观察的方法,研究猪瘟病毒感染对细胞内自噬相关蛋白LC3表达及定位的影响;然后用自噬诱导剂雷帕霉素或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理猪肾细胞,通过病毒滴度测定研究细胞自噬对病毒复制的影响。发现在病毒感染24h后自噬相关蛋白LC3由LC3-Ⅰ酯化为LC3-Ⅱ,并观察到病毒感染的细胞中出现了LC3蛋白聚点;细胞自噬体的诱导能显著增加病毒滴度。本研究表明猪瘟病毒在感染细胞后能诱导细胞自噬,该细胞自噬过程有利于病毒的增殖。     

猪宿主蛋白G3BP1对猪圆环病毒2型在PK15细胞上复制的影响

猪宿主蛋白G3BP1在宿主抵抗病毒感染过程中起着重要作用,然而还未有相关报道G3BP1与猪圆环病毒2型(PCV2)感染过程中的联系.本文构建了G3BP1真核表达载体和干扰RNA,实现在PK15细胞上G3BP1的过表达及敲低.结果 发现,PCV2感染细胞24h后病毒复制出现显著差异,感染48h相比于感染24h病毒复制差异...     

细胞自噬对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

本研究旨在了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)诱导的细胞自噬在病毒感染过程中所起的作用。用Oregon C24V株感染MDBK细胞,以Western blot、间接免疫荧光、透射电镜三种方法鉴定细胞自噬的产生;通过自噬抑制药物Wortmannin和自噬基因Beclin-1的RNAi干扰阻断自噬,探究自噬对BVDV复制的影响。结果显示,病毒感染可以引起LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化及p62的降解;转染GFP-LC3质粒的细胞,在病毒感染后出现增多的聚集颗粒;透射电镜能观察到细胞中出现大量的双层膜结构;此外,抑制细胞自噬或干扰Beclin-1的表达,细胞上清中病毒的滴度及病毒蛋白质的表达量都有所降低。BVDV感染早期可以诱导自噬的产生,且自噬对病毒的复制有利。     

猪流行性腹泻病毒感染Vero-E6细胞诱导凋亡机制的研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞凋亡的机理,本研究利用荧光定量PCR方法结合流式细胞术检测PEDV感染Vero-E6细胞后凋亡分子的变化情况.荧光定量PCR结果表明,抑制细胞凋亡因子Bcl-2在PEDV感染后基因转录水平迅速升高,在24 h达到峰值后被抑制;而促凋亡因子的蛋白水解酶caspase8和caspase3在PEDV感染后基因转录水平也随之提高,在48 h达到峰值.流式细胞术结果表明PEDV感染细胞48 h后促凋亡分子中的蛋白水解酶Caspases被活化.该研究结果揭示了PEDV感染细胞能够拮抗细胞存活信号通路,引起细胞凋亡,其中凋亡调节因子Bcl-2、caspase3和caspase8在细胞凋亡发生过程中起关键作用.     

不同毒力水貂阿留申病毒在猫肾细胞中的增殖特性及凋亡特性的比较研究

试验旨在对不同毒力水貂阿留申病毒（Aleutian mink disease virus,AMDV）在猫肾细胞（feline kidney cell,CRFK）中的增殖规律及其诱导细胞凋亡情况进行比较研究。将标准毒株AMDV-G及分离到的野毒株AMDV-DL124、AMDV-DL125、AMDV-QD2、AMDV-QD3、AMDV-ZJ3接种CRFK细胞,应用间接免疫荧光、实时荧光定量PCR、TCID₅₀测定技术研究病毒在细胞中的复制及表达情况,同时检测病毒诱导的细胞凋亡情况。间接免疫荧光结果显示,5株野毒株荧光着色趋势差异不大,均在感染后12 h出现荧光,随感染时间延长荧光增多,AMDV-G荧光出现时间比野毒株晚,但病毒感染后72 h几乎所有细胞均出现荧光;实时荧光定量PCR结果显示,基因组复制趋势大致相同,AMDV-DL125感染后3 h复制开始,AMDV-G感染后24 h复制才开始并呈快速增长趋势,但感染后72 h均达到峰值。TCID₅₀检测结果表明,0~12 h为病毒感染潜伏期,AMDV-G感染后60 h达到峰值,野毒株均在感染后72 h达到峰值,但是6株病毒均能在感染后48~72 h维持较高的感染滴度,其后随细胞崩解而降低。SPSS 23.0统计软件分析凋亡检测结果显示,与对照组相比,野毒株感染细胞后2~12 h诱导细胞凋亡差异显著（P<0.05）,AMDV-G诱导细胞凋亡差异明显低于野毒株,但是诱导细胞凋亡时间较野毒株长,在感染后24 h仍对细胞凋亡有较明显的诱导作用,但是各病毒诱导的细胞凋亡主要集中在2~12 h。该结果为AMDV的培养、鉴定及致病机理研究提供一定参考。     

中药复方提取物对细胞抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染能力的影响

中药复方提取物经临床验证对预防猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型等引起的疾病有效。本试验测定细胞安全浓度范围内中药复方提取物对细胞抗PRRSV感染能力的影响。试验用中药主要成分为虎杖、女贞子、杠板归等。提取方法为水浸,旋转蒸发干燥。制成生药原液浓度为25mg／mL,稀释成2500、1250、625．0、312．5、156．25、78．13、39．06、19．53、9．77、4．88ug／mL。培养细胞选用Marc-145。试验方法：1）细胞培养液中加入0．1mL中药提取物培养2h后加入PRRSV病毒液0．1mL,培养72h;2）细胞培养液中加入病毒液0．1mL培养2h后加入中药提取物0．1mL,培养72h;3）同时将各浓度中药提取物0．1mL和病毒液0．1mL加入细胞培养液中;3种加药方式均设细胞对照和病毒对照,每个浓度设4～6个重复。结果表明,第1种加药方式下,19．53—2500ug／mL效果显著,其中39．06ug／mL效果最好;第2种加药方式下,156．25～2500ug／mL效果显著,1250ug／mL效果最佳;第3种方式下,19．53—2500ug／mL效果显著,2500ug／mL效果最好。这可能是中药复方提取物预防PRRSV感染的作用机制之一。     

中药成分对传染性法氏囊病毒感染细胞的影响

将黄芪多糖、当归多糖、蜂胶多糖、淫羊藿多糖、板蓝根多糖、黄芪黄酮、蜂胶黄酮、淫羊藿黄酮、黄芪皂甙、人参皂甙等 1 0种中药成分与鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV)以 3种顺序加入到培养 2 4h的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中。即先加中药后接种病毒、先接种病毒后加中药、中药和病毒同时加入 ,观察细胞病变的程度 ,以评价它们对IBDV感染细胞的影响。结果表明 ,先加中药后接种病毒和中药与病毒同时加入时 ,多数中药成分处理组在病毒接种后 72h的细胞病变程度明显减轻 ,表明多数中药能抑制病毒感染细胞 ,且有一定的量效和时效关系。     

水牛原代体细胞慢病毒感染体系的建立

试验旨在建立水牛原代体细胞慢病毒感染体系。通过比较慢病毒(lentivirus)感染水牛颗粒细胞(buffalo granulosa cell,BuGC)、水牛乳腺上皮细胞(buffalo mammary epithelial cell,BuMEC)、水牛成纤维细胞(buffalo fibroblast cell,BuFC)的效率及荧光强度,筛选出3种水牛原代体细胞的最佳感染复数(MOI)。分离培养获得BuGC、BuMEC及BuFC。将慢病毒质粒pLVX-Puro-GFP和包装质粒pSPAX2、pMAD2.G脂质体转染HEK293T细胞,于转染后48和72 h收集病毒并通过稀释计数法测定慢病毒滴度。将慢病毒按不同的感染复数(100、200、400、600、800)感染BuGC、BuMEC和BuFC,感染72 h后于倒置荧光显微镜下观察拍照,统计感染效率及荧光强度。慢病毒感染3种水牛原代体细胞后,用嘌呤霉素筛选。结果显示,在MOI≤200时,慢病毒感染后细胞荧光强度BuMEC最强,而BuGC和BuFC间无显著差异;在MOI≥400时,慢病毒感染后细胞荧光强度为:BuMECBuGCBuFC。在MOI=100时,慢病毒感染效率为:BuGCBuMECBuFC;在MOI=200时,BuMEC和BuGC感染效率达到100%;在MOI=800时,BuFC感染效率达到100%。不同细胞类型对慢病毒的毒性耐受存在差异,在嘌呤霉素的筛选和维持下,获得了3种水牛原代体细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)过表达慢病毒稳转细胞株。慢病毒感染BuMEC、BuGC、BuFC的最佳MOI分别为200、400和800;3种水牛原代体细胞均能通过慢病毒获得过表达外源基因细胞株。本研究结果为水牛的乳腺组织发育分化、泌乳调控、生殖发育及转基因动物制备等提供了较好的细胞模型。     

水牛原代体细胞慢病毒感染体系的建立

试验旨在建立水牛原代体细胞慢病毒感染体系。通过比较慢病毒（lentivirus）感染水牛颗粒细胞（buffalo granulosa cell,BuGC）、水牛乳腺上皮细胞（buffalo mammary epithelial cell,BuMEC）、水牛成纤维细胞（buffalo fibroblast cell,BuFC）的效率及荧光强度,筛选出3种水牛原代体细胞的最佳感染复数（MOI）。分离培养获得BuGC、BuMEC及BuFC。将慢病毒质粒pLVX-Puro-GFP和包装质粒pSPAX2、pMAD2.G脂质体转染HEK293T细胞,于转染后48和72 h收集病毒并通过稀释计数法测定慢病毒滴度。将慢病毒按不同的感染复数（100、200、400、600、800）感染BuGC、BuMEC和BuFC,感染72 h后于倒置荧光显微镜下观察拍照,统计感染效率及荧光强度。慢病毒感染3种水牛原代体细胞后,用嘌呤霉素筛选。结果显示,在MOI≤200时,慢病毒感染后细胞荧光强度BuMEC最强,而BuGC和BuFC间无显著差异;在MOI≥400时,慢病毒感染后细胞荧光强度为：BuMEC>BuGC>BuFC。在MOI=100时,慢病毒感染效率为：BuGC>BuMEC>BuFC;在MOI=200时,BuMEC和BuGC感染效率达到100%;在MOI=800时,BuFC感染效率达到100%。不同细胞类型对慢病毒的毒性耐受存在差异,在嘌呤霉素的筛选和维持下,获得了3种水牛原代体细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）过表达慢病毒稳转细胞株。慢病毒感染BuMEC、BuGC、BuFC的最佳MOI分别为200、400和800;3种水牛原代体细胞均能通过慢病毒获得过表达外源基因细胞株。本研究结果为水牛的乳腺组织发育分化、泌乳调控、生殖发育及转基因动物制备等提供了较好的细胞模型。