禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(High pathogenicity island HPI)流行情况和基因特征,根据Gen Bank已知禽源irp2基因序列,设计、合成一对特异性引物,建立irp2基因PCR检测方法,优化、确定PCR扩增特性,进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示,建立的PCR检测方法敏感性可达2.14×10~(-4)ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测,变异系数3.4%~5.0%。256份临床样品PCR检测irp2基因,阳性率30.6%。获得了9株分离株irp2基因序列,分析显示,与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。     

鸡源大肠杆菌中HPI和LEE毒力岛相关基因的检测

采用PCR方法检测辽宁锦州地区分离的150株鸡源大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛基因(HPI)和肠细胞脱落位点毒力岛(LEE),利用多重PCR方法检测HPI irp2和fyuA基因,以及LEE ler和eaeA基因.在分离的鸡源大肠杆菌中,HPI毒力岛基因检测结果为:18.7％的菌株irp2和fyuA基因扩增阳性,6.7％的菌株irp2基因阳性;LEE毒力岛基因检测结果为:15.3％的菌株ler和eaeA基因扩增阳性.结果表明,25.3％的鸡源大肠杆菌携带HPI,15.3％的鸡源大肠杆菌携带LEE.     

肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因缺失株的毒力相关功能研究

为研究肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因在肠炎沙门菌感染中的毒力作用,利用Red同源重组系统对2株肠炎沙门菌(国内标准株50336和国际参考株SD-2)SPI-19的Hcp基因进行敲除,成功构建了50336ΔHcp和SD-2ΔHcp基因缺失株,并构建了回补株50336ΔHcp/pHcp和SD-2ΔHcp/pHcp。分析比较缺失株与野生株对人肠上皮细胞系Caco-2黏附和侵袭能力,以及在鸡巨噬细胞HD11的存活能力。结果显示:缺失Hcp基因后,肠炎沙门菌50336对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降39.1%和47.9%;SD-2对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降46.5%和58.9%。吞噬作用2h后,50336ΔHcp和SD-2ΔHcp与野生株相比在HD11的存活量下降了35.7%和37.2%,差异显著。通过Real Time-PCR试验分析,与野生株相比,Hcp基因缺失后fliC、sefA、ompA,ompC这4个重要粘附因子编码基因的表达量显著下降。试验表明,肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因对肠炎沙门菌的毒力具有增强作用。     

银川地区鸡源致病性大肠杆菌耶尔森菌强毒力岛相关基因的检测及序列分析

为了研究耶尔森菌强毒力岛(HPI)在银川地区鸡源致病性大肠杆菌中的分布情况,试验根据HPI相关基因irp2和fyuA的参考序列设计引物,采用双重PCR方法对分离的20株鸡源致病性大肠杆菌进行这两种基因的扩增和检测,以及基因克隆和核苷酸序列分析。结果表明:irp2和fyuA基因在鸡源致病性大肠杆菌分离株中的阳性率均为40%(8/20);这两种毒力岛相关基因的核苷酸序列与GenBank中报道的基因核苷酸同源性高达98%以上。说明irp2和fyuA基因具有较高的保守性。     

鸡白痢沙门菌htrA基因缺失株的构建及其相关生物学特性研究

为研究丝氨酸蛋白酶HtrA对鸡白痢沙门菌在巨噬细胞内生存的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了鸡白痢沙门菌(ATCC19945) htra基因缺失突变株(ATCC19945Δhtra),通过测定其巨噬细胞内存活能力、应激条件实验,探究Htr A蛋白在鸡白痢沙门菌致病过程中的作用。结果显示,缺失株ATCC19945Δhtra与野生型菌株和回复菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其巨噬细胞内存活能力显著降低。应激环境试验结果表明,htra基因缺失后鸡白痢沙门菌对pH、热和H_2O_2氧化应激的敏感性增加,在蛋清中生存能力下降,生物被膜形成能力显著下降。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门菌的胞内存活机制、疫苗开发奠定基础。     

致病性大肠杆菌HPI对Caspase-1细胞焦亡相关分子表达的影响

为研究云南撒坝猪致病性大肠杆菌高致病性毒力岛(HPI)致猪源巨噬细胞焦亡的分子机制,本试验以云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI阳性株感染猪源巨噬细胞为切入点,从云南楚雄州某规模养殖场采集撒坝猪仔猪黄白痢的粪便,对大肠杆菌进行分离纯化,并通过PCR技术对HPI irp2基因进行检测,分别以HPI阳性株(HPI~+)和阴性株(HPI~-)感染巨噬细胞,并设立LPS+ATP组和空白对照组,于0.5和6 h收集各组细胞及其上清。应用实时荧光定量PCR法检测不同组Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平的变化;应用ELISA检测细胞上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量的变化。结果显示,试验成功分离得到致病性大肠杆菌,经PCR检测成功获得HPI irp2基因阳性株,经实时荧光定量PCR法检测后发现HPI~+组、HPI~-组与空白对照组相比,Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平均呈上调趋势,且HPI~+组高于HPI~-组。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,HPI~+组和HPI~-组pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的蛋白表达量普遍呈上调趋势,且HPI~+组均高于HPI~-组。结果表明,云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI可通过上调猪源巨噬细胞中Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表达量促进猪源巨噬细胞炎性因子IL-1β和IL-18的释放,诱发炎症,最终促进猪源巨噬细胞发生细胞焦亡。     

毛皮动物源大肠埃希菌毒力基因二重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测毛皮动物源大肠埃希菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)中irp2、FyuA毒力基因的二重PCR方法,根据GenBank中irp2、FyuA基因的序列,设计并合成两对引物,扩增得到irp2、FyuA基因片段,大小分别为300bp和951bp。据此建立双重PCR方法,并将反应条件进行了优化。结果表明,用所建立的二重PCR方法可同时特异性扩增出大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因片段,对沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌均无特异性扩增。菌液最低检出量为2.8×105CFU/mL。在78份临床样品检测中,二重PCR检测结果与常规PCR检测结果一致。所建立的大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因二重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能够提高临床样品检测的效率。     

利用SCOTS技术筛选鸡白痢沙门菌感染巨噬细胞的转录序列

沙门菌在巨噬细胞内的存活是其在宿主内长期定植的主要因素之一,研究利用选择性捕获转录技术(SCOTS)筛选鸡白痢沙门菌S06004株在感染鸡巨噬细胞系HD-11过程中细菌表达的基因.结果显示:鸡白痢沙门菌以MOI值为100:1感染HD-11细胞1h后,感染率达11.75％;选取感染1h时间点作为研究对象,利用SCOTS技术获得了12个鸡白痢沙门菌的转录序列,包括与沙门菌感染相关的毒力基因调控因子invF;构建了invF、tehB和tolC基因插入突变株.突变株侵入HD-11的能力明显低于野生株,反映了SCOTS筛选获得的基因在鸡白痢沙门菌感染巨噬细胞时发挥重要的作用,为深入揭示鸡白痢沙门菌的感染机制提供了基础.     

鼠伤寒沙门菌CVCC541 rhs基因内部元件缺失株的构建及其功能

利用Red同源重组系统构建5株rhs内部元件缺失株以及回补株,并通过HeLa细胞黏附和侵袭试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬后存活试验、小鼠致病力试验鉴定rhs内部元件缺失后对菌株黏附能力、侵袭能力和小鼠致病力的影响。旨在通过敲除鼠伤寒沙门菌CVCC541的2个rhs基因的内部元件rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core和rhs-2C构建相应缺失株及回补株,研究其对该菌侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明,鼠伤寒沙门菌rhs基因内部元件的缺失均增强了其黏附侵袭和抗吞噬能力,但极显著降低了该菌的致病力。回补株对生长速率没有影响,其黏附侵袭能力与亲本株相比没有显著差异,抗吞噬能力与亲本株相比均有显著差异,对小鼠致病力与亲本株相比显著降低。     

APEC强毒力岛核心基因irp2、fyuA敲除对其致病性影响的研究

采用Red同源重组技术分别构建出APEC irp2单基因敲除株△AE17和irp2、fyuA双基因敲除株△△AE17。运用活菌计数法分别观察AE17、△AE17、△△AE17黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力。并且应用Real-time PCR检测AE17、△AE17和△△AE17中的luxs,pfs,tsh,ibeA,stx2f,iss,ompA,fimC 8个毒力基因转录水平。结果成功构建出基因敲除株△AE17和△△AE17,它们黏附DF-1细胞的能力分别下降为AE17的66.04%和53.54%。同时,Real-time PCR结果显示,△AE17的luxs,iss,ompA和fimC等4个毒力基因的转录水平均极显著下降(P<0.01),△△AE17的luxs,pfs,tsh,iss,ompA和fimC等6个毒力基因的转录水平极显著的下降(P<0.01)。结果表明强毒力岛中核心基因的敲除能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使其毒力基因的转录水平有所降低。irp2、fyuA双基因敲除较irp2单基因敲除对APEC的致病性影响更显著。     

WzxE蛋白影响鸡白痢沙门氏菌致病性的研究

wzx/wzy是调控革兰氏阴性菌O抗原合成的主要途径,对细菌的生存、代谢乃至致病性均具有重要作用。为研究该基因簇中wzxE基因对鸡白痢沙门氏菌致病性的影响,本研究通过同源重组方法构建了鸡白痢沙门氏菌参考菌株ATCC19945的wzxE基因缺失菌株(ATCC19945 ΔwzxE),通过生长特性试验、应激试验、细菌蛋清存活能力测定、1日龄雏鸡感染试验对比基因缺失突变株与野生菌株、回补株的生物学特性及分析WzxE蛋白功能。结果显示,wzxE基因缺失并未影响白痢沙门菌的生长特性。应激试验显示,wzxE基因缺失会导致鸡白痢沙门菌在酸性和H_2O_2处理条件下生存能力的显著下降,回补之后得到明显回复。细菌蛋清存活能力检测结果显示,wzxE基因缺失株较野毒株在蛋清内的存活能力下降明显,回补之后存活能力显著增强。1日龄雏鸡感染试验结果显示,鸡白痢沙门菌ATCC19945野生菌株、wzxE基因缺失株和回补株对雏鸡的半数致死量分别为1. 65×10~8cfu、4. 67×10~8cfu和3. 43×10~8cfu,毒力下降不明显。提取鸡白痢沙门菌参考株和缺失株LPS,经SDS-PAGE后银染检测显示,wzxE缺失不影响鸡白痢沙门菌LPS总体成分构成,但影响特定LPS特定寡糖单位的含量。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门氏菌细菌毒力的影响因素、疫苗开发奠定基础。     

PEC HPI irp2基因缺失株的构建及蛋白结构功能预测

为了探讨致病性大肠杆菌内HMWP2蛋白的生物学结构和功能,采用Red同源重组技术,对致病性E.coli的HPI irp2基因进行敲除,成功构建了致病性E.coli irp2基因缺失株,并利用测序结果对HMWP2蛋白进行了多重预测分析,以期为致病性大肠杆菌相关疾病的防治和发生机理研究提供理论基础。     

禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2蛋白表达、纯化及其间接ELISA方法建立

PCR扩增irp2主要抗原表位区,构建pET-32α-irp2表达载体,转化BL21(DM3)细胞诱导表达。以纯化irp2蛋白为抗原建立ELISA检测方法,确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液与封闭条件和临界值等参数,进行ELISA性能检测及应用。结果显示,PCR扩增出约519bp特异性irp2主要抗原表位基因,经菌液PCR、双酶切及DNA测序显示成功构建pET-32α-irp2表达载体。irp2目的蛋白获得有效表达,相对分子质量大小约34 500,亲和纯化后纯度达90%以上。Western blot显示目的蛋白irp2与抗血清在约34 500出现特异性显示条带。确定ELISA抗原包被质量浓度3.25mg/L、血清稀释度1∶80,封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件37℃1h+4℃10h,临界值为0.320。性能检测显示,其敏感性可达1∶5 120;与鸡白痢沙门菌、鸡传染性鼻炎、鸡霉形体、鸡巴氏杆菌、HPI-大肠杆菌等血清无交叉反应特异性,批内、批间变异系数分别为3.40%~6.71%和5.20%~8.44%;与PCR方法对124份血清平行试验其符合率93.8%;对1 425份临床血清样品irp2抗体阳性检出率37.4%。结果表明,建立了可检测血清中irp2蛋白抗体的间接ELISA方法,适用于临床血清样品进行快速抗体检测,为HPI大肠杆菌的流行病学调查和致病性大肠杆菌免疫机制研究奠定基础。     

鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用

分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带,鸡伤寒沙门菌显示417 bp和636 bp两个条带,而阴性对照未出现条带,与预期设计相符。双重PCR体系对56株不同血清型沙门菌鉴定结果与细菌学分离的血清型鉴定结果完全一致,说明本试验建立的双重PCR体系特异性良好,应用上述方法检测鸡场疑似20份临床样本,结果发现8株鸡白痢沙门菌阳性,1株鸡伤寒沙门菌阳性。上述结果表明,已建立双重PCR方法特异性检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。本试验为鸡白痢和鸡伤寒不同生物型沙门菌的检测提供了一种简洁、敏感、特异的新方法。     

肠炎沙门菌双组份系统qseC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为研究肠炎沙门菌qseC基因功能,构建qseC缺失株C50041ΔqseC以及回复株C50041ΔqseC::qseC,分析qseC基因缺失对肠炎沙门菌生化特性、生长曲线、运动性、黏附侵袭等方面的影响,探究该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。结果显示:利用框内缺失突变技术成功获得肠炎沙门菌C50041ΔqseC缺失株,以野生株C50041、回复株C50041ΔqseC::qseC为对照,发现C50041ΔqseC缺失株的生化特性、生长曲线与C50041野生株一致,但其运动性(P=0.001 9)以及对巨噬细胞J774A.1的黏附率(P=0.032 5)、侵袭率(P=0.005 3)相比野生株显著下降。研究提示:qseC基因的缺失对肠炎沙门菌的生化特性和生长曲线没有影响,但会显著降低肠炎沙门菌的运动能力及对宿主细胞的黏附和侵袭。研究初步探究了肠炎沙门菌qseC基因的功能,为后续深入研究奠定基础。     

沙门菌sopB基因缺失诱导小鼠巨噬细胞死亡的研究

沙门菌是一种胞内寄生菌,能够引起人和多种动物疾病,是一种世界范围内的重要疾病。为了更好理解在沙门氏菌感染过程中效应蛋白SopB对巨噬细胞存活的影响,利用鼠伤寒沙门菌SL1344和sopB基因缺失菌株分别感染小鼠骨髓来源的巨噬细胞,对2株菌在巨噬细胞内存活情况进行统计。随后用Western blot检测DNA修复酶PARP的剪切情况,通过ELISA检测培养上清中细胞因子和趋化因子的分泌情况。结果发现sopB基因缺失之后,沙门菌在巨噬细胞内的存活显著降低;培养上清中细胞因子和趋化因子分泌增强,巨噬细胞坏死增加。说明sopB基因缺失可促进巨噬细胞坏死。     

多黏菌素E对鸡源性大肠杆菌和沙门菌的PAE及其机制初探

从发病鸡的粪便中分离出具有多重耐药性的大肠杆菌O18和鸡白痢沙门菌O2,检测多黏菌素E的最小抑菌浓度(MIC)和抗生素后效应(PAE),测定多黏菌素E接触过的细菌各组乳酸脱氢酶(LDH)和γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)活性变化、电镜观察细胞膜形态、巨噬细胞吞噬细菌数量和细菌对Caco-2的黏附力。多黏菌素E作用后,菌液中LDH和γ-GT活性显著性增高(P0.01),细菌胞膜出现破损或缺失,细菌形态改变,被巨噬细胞吞噬的菌量明显增多(P0.01),细菌对Caco-2的黏附力显著下降(P0.01)。多黏菌素E对鸡源性多重耐药菌株存在PAE,推测其产生机制为破坏细菌细胞膜,改变细菌形态,促进巨噬细胞对细菌的吞噬能力增强,降低细菌对细胞黏附力。     

禽源肠炎沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

试验旨在研究aroA基因对肠炎沙门菌生物学特性及毒力的影响。利用λ-Red同源重组技术，将从田间分离的禽源肠炎沙门菌的aroA基因进行敲除，经连续传代检测缺失株遗传稳定性，并通过细菌生长曲线、对不同生化反应管的利用情况、生物膜形成能力、对环境应激的抵抗能力及对1日龄雏鸡的毒力比较野生株和基因缺失株之间的差异。结果显示，试验成功构建缺失株，连续传30代未发现目的基因回复突变；在相同培养条件下，缺失株与野生株在相同时间进入对数生长期和稳定期，但缺失株生长速率低于亲本株；缺失株较野生株生化特性未发生改变；缺失株的生物膜形成能力及对酸、碱、高渗和热应激的抵抗能力均显著低于野生株（P<0.05）；1日龄雏鸡分别滴口接种缺失株和野生株，观察14 d，野生株组鸡全部死亡，而缺失株组无死亡。综上所述，本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的肠炎沙门菌aroA基因缺失株，缺失株生化特性和体外生长趋势未发生明显改变，但生物膜形成能力、对环境应激抵抗能力及毒力均明显下降。本研究为进一步研究肠炎沙门菌aroA基因缺失株的免疫原性奠定了基础。     

胞内分枝杆菌及偶发分枝杆菌对小鼠巨噬细胞凋亡的影响

为了研究非结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡的影响,采用胞内分枝杆菌和偶发分枝杆菌分别感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,流式细胞术检测细胞凋亡率,ELISA法检测TNF-α及IL-10的表达,检测这2株菌在小鼠巨噬细胞中的增殖。结果显示:胞内分枝杆菌引起的细胞凋亡水平低于偶发分枝杆菌组(P0.05),这2株菌所引起的TNF-α的表达量在4 h、12 h较高,与空白对照组相比差异显著(P0.05),在24 h、48 h下降明显,而IL-10的表达整个感染过程都比较高。并且还观察到胞内分枝杆菌的吞噬率较高(P0.05);增殖能力较强(P0.01)。表明菌体毒力与凋亡率、细胞因子的表达、增殖率有着直接关系。     

105株携带耶尔森菌强毒力岛大肠杆菌的毒力基因型和部分菌株毒力因子序列研究

为了解105株携带耶尔森菌强毒力岛(HPI)的大肠杆菌(E.coli)中相关毒力因子的流行情况和基因序列,根据GenBank中参考序列设计引物,采用PCR方法对广东地区养殖场来源的105分离株HPI+E.coli的fyuA、tsh、iucD、iss 4种毒力基因进行检测,统计基因类型;并对部分分离株的5种毒力基因(irp2和fuA、tsh、iucD、iss)进行了克隆与序列分析.结果显示105株HPI+E coli中4种毒力因子携带情况不尽一致,基因fyuA、tsh、iucD和iss的阳性率分别为55.24％、17.14％、49.52％和23.81％,105株HPI+E.coli共有13种基因型;分析表明,除iss基因与参考序列的同源性在88.0 ％～90.9％外,irp2、fyuA、tsh、iucD4种基因与GenBank中参考序列的同源性高达96％以上;广东省养殖场E.coli毒力因子基因型复杂,并以基因型irp2+ fyuA+ iucD+和仅含irp2+的菌株分离率最高,分别为17.14％和28％.