鸡源致病性大肠埃希菌菌毛基因研究进展

菌毛是鸡大肠埃希菌的重要致病因子之一。文章对鸡源致病性大肠埃希菌菌毛的特点及分类,各型菌毛亚单位基因结构及其功能与控制,鸡源致病性与其他动物源大肠埃希菌菌毛之间的同源性进行了综述。这对了解菌毛亚单位基因结构与致病力的关系,探讨鸡源大肠埃希菌的致病力与分布有重要意义。     

鸡大肠埃希菌Ⅰ型菌毛pilA基因的克隆与序列分析

根据已公布的鸡大肠埃希菌pilA基因序列,在其保守区设计一对引物,以提取的3株鸡大肠埃希菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得3个克隆片段。经序列测定和分析表明,3株克隆片段均含有Ⅰ型菌毛pilA基因的全序列及完整的开放性阅读框架,片段大小为549bp,编码信号肽和结构蛋白;3株鸡大肠埃希菌分离菌株与其他菌株pilA基因之间核苷酸同源性为87.25%～98.36%,氨基酸同源性为87.36%～98.35%;系统进化分析表明,大肠埃希菌各菌株之间的pilA基因遗传相关性与其宿主来源及血清型之间没有显著的相关性;3株鸡大肠埃希菌I型菌毛间具有一定的结构相似性,并存在一定的共同抗原位点。     

华南虎源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

从患病华南虎分离病原菌,进行快速鉴定,同时以大肠杆菌16S rRNA基因的通用引物和irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR扩增、测序,并将扩增出来的irp2、iucD、iss基因序列与Genbank相应序列进行同源性分析。测序鉴定为大肠埃希氏菌,与传统细菌鉴定方法结果相一致,分离菌携带irp2、iucD、iss毒力基因,从毒力试验得到证实。其序列与Genbank上发表的iucD、iss基因序列同源性分别高达98%、99%,而irp2基因序列的同源性仅为48%。采用16S rRNA基因序列分析法可以对华南虎大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,华南虎源性大肠杆菌同时携带有irp2、iucD、iss 3个毒力基因,可能与其致病性有关系。     

鸡源大肠埃希氏菌某些生物学特性研究

鸡源大肠埃希氏菌某些生物学特性研究恽时锋郑明球＊蔡宝祥＊（南京军区南京总医院动物实验科２１０００２）本文研究了从江苏分离的鸡源大肠埃希氏菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）代表菌株的某些生物学特性及其与致病性之间的关系，包括对１日龄鸡的致病性、溶血特性、菌毛的表达及电...     

检测987p^＋肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立

以987p菌毛结构基因保守序列为靶序列，设计合成了1对可扩增459bp目的片段的引物，建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K88^ ( 为菌毛阳性）、K99^ 、F41^ 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性；该方法的敏感度可达10^2CFU，对20株腹泻仔猪粪例分离物进行检测，有1株为阳性，与血清学检测的结果一致。结果表明，此方法特异性和敏感性都很高，可用于临床987p肠毒素性大肠埃希氏菌病的快速诊断和流行病学调查。     

整合子参与的大肠埃希氏菌多重耐药机制的研究

细菌耐药是一个严重的世界性难题。目前大肠埃希氏菌呈现多重耐药趋势,给临床抗感染治疗带来困难。大肠埃希氏菌染色体中存在多重耐药操纵子(maroperon),该操纵子编码的蛋白产物MarA可通过对数个远程基因的调控,影响大肠埃希氏菌细胞膜通透性、主动外排泵系统,形成大肠埃希氏菌     

一株O1血清型鸡大肠埃希菌iss基因的序列分析

采用1日龄雏鸡对1株O1血清型鸡源大肠埃希菌(E.coli)的致病性进行测定,并扩增iss基因.结果表明,鸡E.coli O1对1日龄雏鸡具有较强的毒力.iss基因在致病性鸡E.coli O1中的序列与已知禽大肠埃希菌iss基因序列同源性为100%,与人源大肠埃希菌iss基因核苷酸,序列同源性为90.9%,显示了此基因具有保守性.     

鸡源大肠埃希氏菌某些生物学特性

对鸡源大肠埃希氏菌的某些生物学特性进行了研究,包括对１日龄鸡的致病性、溶血性、菌毛的表达、血凝性、对鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）的粘附特性、体内外与鸡气管粘膜的粘附特征、质粒特征、全菌蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳及免疫转印等。结果表明,鸡源大肠埃希氏菌的溶血性、质粒特征、对ＣＥＦ的粘附特性与其致病性无关;菌毛与致病性有关,大部分菌株表达Ⅰ型菌毛;血凝能被Ｄ－甘露糖抑制,不同菌株血凝谱具有差异;体内外与气管粘膜的粘附特性与菌株致病性有关;在全菌蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳中,相对分子质量约为４０７００的多肽仅存在于具有致病性的菌株中,经免疫转印证实,该多肽为致病性大肠埃希氏菌所特有     

树鼩源大肠埃希氏菌耐药性分析与毒力因子鉴定

为了解树鼩源大肠埃希氏菌遗传进化同源性、对药物的敏感性以及所携带的毒力因子种类等,对广西南宁某大学人工驯化养殖的10只树鼩肠道内容物进行大肠埃希氏菌的分离纯化、生化分析及药敏试验等,并应用PCR技术对菌株进行16S rRNA同源性分析、毒力基因及耐药基因的检测.10份树鼩肠道内容物经分离纯化共分离出9株大肠埃希氏菌.同...     

广东水禽源大肠埃希菌耐药性及氨基糖苷类耐药基因研究

为了调查广东地区水禽源大肠埃希菌对氨基糖苷类药物耐药现状和耐药基因的流行情况,探索大肠埃希菌的氨基糖苷类耐药基因型与耐药表型之间的关系,本研究采用琼脂梯度稀释法测定251株广东地区水禽源大肠埃希菌对氨基糖苷类药物的耐药性和采用PCR方法检测耐药基因。药敏试验结果显示,大肠埃希菌对链霉素耐药较严重,鸭源和鹅源的耐药率分别为81.58%和75.43%,对庆大霉素和卡那霉素较敏感,耐药率分别为25%和54.86%,对阿米卡星最为敏感,其中鸭源的菌株耐药率仅为1.32%。PCR方法检测显示,aadA1和aph(3′)-1检出率较高,为84.6%和91.9%,表明携带aadA1和aph(3′)-1耐药基因的水禽源大肠埃希菌在广东地区呈流行趋势。耐药基因型与耐药表型相关性分析结果显示,耐药基因rmtB的携带与4种药物(庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素和壮观霉素)耐药株的产生具有显著相关性,表明耐药基因rmtB对大肠埃希菌耐药株的产生起重要的作用。本试验结果可为指导广东地区水禽大肠埃希菌病的临床用药提供理论基础和研究大肠埃希菌的耐药基因提供相关的数据。     

黑颈鹤源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

对黑颈鹤病原菌进行快速鉴定及毒力因子分析。采用16S rRNA序列分析法鉴定黑颈鹤病原菌,其毒力基因分别用大肠杆菌的irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR检测,并将扩增出来的irp2基因序列与Genbank~（TM）相应序列进行同源性分析。分离菌株鉴定为大肠埃希氏菌,鉴定结果与生化检测结果一致,分离菌携带irp2毒力基因,这从毒力试验得到证实,其序列与与Genbank~（TM）上发表的HPI irp2基因序列同源性高达98%以上。采用16S rRNA序列分析法可以对黑颈鹤大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,黑颈鹤源性大肠杆菌携带有irp2毒力基因。     

大肠埃希氏菌F18菌毛FedF蛋白的表达与鉴定

根据已发表的F18菌毛F亚单位的基因序列(fedF)设计了1对引物．利用PCR技术分别扩增到F18ab和F18ac菌毛的fedF编码序列，并按预定的阅读框架分别插入表达载体pGEX-6p-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，获得重组质粒pPFedF／ab与pPFedF／ac，然后转化大肠埃希氏菌BL21获得重组菌PPFedF／ab与PPFedF／ac。测序结果表明，fedF编码序列大小均为837bp，与GenBank中登录的EedF结构编码序列(Z26520)大小一致。通过对菌体裂解物进行SDSPAGE电泳分析以及Western-blotting鉴定，证明重组大肠埃希氏菌PPFedF／ab与PPFedF／ac均可以表达融合蛋白形式的FedF(分别命名为GST-FedF／ab与GST-FedF／ac)。     

牦牛源致病性大肠埃希菌PCR检测方法的建立

为快速诊断犊牦牛大肠埃希菌感染情况,本研究从100份腹泻犊牦牛粪便中分离致病性大肠埃希菌,根据已发表的致病性大肠埃希菌外膜蛋白紧密素eae基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了牦牛源致病性大肠埃希菌PCR检测方法,并经实验验证该方法特异性及敏感性均较好,检测下限为3.6×102 cfu/mL.     

藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的分离与PCR鉴定

为研究外观健康藏系绵羊携带沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌情况,对采自外观健康藏系绵羊的19份肛门拭子进行大肠埃希菌和沙门菌分离鉴定.用选择性培养基及普通PCR方法共分离鉴定出1株沙门菌和13株大肠埃希菌,其中产志贺毒素大肠埃希菌4株,3株含有产志贺毒素基因Stx 1,1株含有产志贺毒素基因Stx 2,沙门菌invA基因和产志贺毒素大肠埃希菌Stx基因同源性分析表明,分离株沙门菌的invA与NCBI上已登录的5种血清型沙门菌核苷酸序列同源性为99.8％,4株产志贺毒素大肠埃希菌与NCBI上已登录菌株的核苷酸序列同源性都大于95％.本研究结果为高原地区藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的流行病学调查奠定了基础.     

鸡源大肠杆菌的分离鉴定及药敏分析

为分析鸡源大肠杆菌的分子流行特点及其耐药情况,研究采用鸡源大肠杆菌分离培养、形态观察、微生物学鉴定、致病性分型鉴定、多重PCR进化分群鉴定(针对arpA、chuA、TspE4.C2和YjaA基因)、药敏分析等.结果 表明:分离出的菌株均为大肠埃希氏菌,属于肠产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC...     

大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位基因的克隆与鉴定

根据已发表的大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位(FedF／ab)的基因(fedF／ab)序列，设计了1对引物，利用PCR技术从大肠埃希氏菌F107／86、YCED1、YCED2、C、D和12F株中分别扩增获得了一段序列，并克隆至pGEM—T载体，获得了重组质粒TF107F、TYCED1F、TYCED2F、TCF、TDF、T12FF。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析，6个重组质粒的大小均为903bp，与fedF／ab基因大小一致。其中大肠埃希氏菌F107／86、YCED1、C和12F株的fedF基因序列完全相同；只有YCED2株在第181位碱基处存在1个C→T的无义变异差异，D株在第655位碱基处存在1个T→C变异差异并在氨基酸水平出现1个S→P变异。结果表明，所克隆的序列均为F18ab菌毛F亚单位的基因。     

大肠埃希氏菌F18菌毛结构蛋白与黏附特性的关系

利用已表达的F18ab和F18ac菌毛各结构亚单位的融合蛋白（GST-FedA／ab、GST-Fe-dA／ac、GST-FedE、（；STFed-F／ab、GST-FedF／ac）分组肌肉注射健康家兔，制备抗FedA／ab、Fe-dA／ac、FedE、FedF／ab、FedF／ac多价血清。结果表明，所制备的5种抗Fed多价血清均能凝集F18ab^＋。大肠埃希氏菌107／86株和F18ac^＋大肠埃希氏菌8813株。利用抗大肠埃希氏菌F18菌毛主要结构亚单位FedA特异抗体和次要结构亚单位FedE、FedF特异抗体，研究了F18菌毛与小肠上皮细胞的黏附特性。结果发现，FedA抗体和FedE抗体单独和合并均不能抑制F18^＋菌与小肠上皮细胞的黏附，而单用抗FedF抗体即能明显抑制F18^＋大肠埃希氏菌与小肠上皮细胞的黏附，表明FedA和FedE与F18菌毛的黏附不具相关性，而FedF才是F18菌毛的黏附性结构亚单位。     

3株猪源大肠埃希氏菌耐药基因的初步定位

本试验旨在对临床分离的猪源大肠埃希氏菌耐药基因进行初步定位。采用常规细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增和序列测定方法从江西省3个规模化猪场送检的子宫脓液中分离鉴定病原菌,并通过质粒提取、转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞及药敏试验对临床分离株的耐药基因进行初步定位。结果显示,分离鉴定到3株大肠埃希氏菌,其中JX-22分离株仅对氧氟沙星、大观霉素敏感,JX-26分离株仅对链霉素、氧氟沙星等4种药物敏感,JX-28分离株仅对氧氟沙星等3种药物敏感,均为多重耐药菌;3株大肠埃希氏菌均可纯化到分子质量大小不一的质粒。分离株、质粒转化菌及大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞药敏试验对比结果显示,3株大肠埃希氏菌的耐链霉素、林可霉素、甲硝唑、氨苄西林、阿莫西林、大观霉素、丁胺卡那基因,JX-22和JX-26分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐头孢曲松基因,JX-28分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟、诺氟沙星基因均定位于细菌质粒上;JX-28分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐诺氟沙星基因和JX-26分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟基因均定位于其染色体上;3株分离株均无氧氟沙星耐药基因。本试验初步确定3株多重耐药猪源大肠埃希氏菌的大部分耐药基因定位于质粒上,为进一步研究猪源大肠埃希氏菌的耐药机理和有效控制措施奠定基础。     

3株猪源大肠埃希氏菌耐药基因的初步定位

本试验旨在对临床分离的猪源大肠埃希氏菌耐药基因进行初步定位。采用常规细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增和序列测定方法从江西省3个规模化猪场送检的子宫脓液中分离鉴定病原菌,并通过质粒提取、转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞及药敏试验对临床分离株的耐药基因进行初步定位。结果显示,分离鉴定到3株大肠埃希氏菌,其中JX-22分离株仅对氧氟沙星、大观霉素敏感,JX-26分离株仅对链霉素、氧氟沙星等4种药物敏感,JX-28分离株仅对氧氟沙星等3种药物敏感,均为多重耐药菌;3株大肠埃希氏菌均可纯化到分子质量大小不一的质粒。分离株、质粒转化菌及大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞药敏试验对比结果显示,3株大肠埃希氏菌的耐链霉素、林可霉素、甲硝唑、氨苄西林、阿莫西林、大观霉素、丁胺卡那基因,JX-22和JX-26分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐头孢曲松基因,JX-28分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟、诺氟沙星基因均定位于细菌质粒上;JX-28分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐诺氟沙星基因和JX-26分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟基因均定位于其染色体上;3株分离株均无氧氟沙星耐药基因。本试验初步确定3株多重耐药猪源大肠埃希氏菌的大部分耐药基因定位于质粒上,为进一步研究猪源大肠埃希氏菌的耐药机理和有效控制措施奠定基础。     

鸡源大肠埃希氏菌流行病学调查及耐药性分析

为了解广东韶关地区鸡源大肠埃希氏菌的流行病学及其耐药性特点,本研究通过2022年对采集自广东韶关地区41个规模养鸡场和28个土鸡散养场的鸡喉头、肛门粪便、病死鸡的肝脏、心血、脾、肠道内容物共737份样品进行细菌分离纯化、病原菌的生化鉴定和药敏试验,研究广东韶关地区鸡源大肠埃希氏菌的流行病学及其耐药性特点。结果显示,541份样品分离到大肠埃希氏菌,检出率73.41%,总体泄殖腔大肠埃希氏菌检出率87.78%,咽喉部大肠埃希氏菌检出率58.24%,死鸡病料大肠埃希氏菌检出率78.38%,规模场大肠埃希氏菌检出率为73.72%,散养场大肠埃希氏菌检出率为73.01%。分离菌株普遍对阿奇霉素、头孢噻肟、阿米卡星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星敏感,对青霉素、氨苄西林、链霉素、卡那霉素、四环素、阿莫西林、氟苯尼考、泰乐菌素、林可霉素、克林霉素耐药,多重耐药比高达79.71%。规模场分离菌多重耐药比为97.56%,散养场多重耐药比为53.57%。本研究为广东韶关地区鸡源大肠杆菌病的防控提供了参考。