免疫刺激复合物(ISCOM)疫苗的研究进展

综述了免疫刺激复合物(ISCOM)的结构和组成,其所制疫苗引起的抗体应答、细胞应答和粘膜应答的研究近况.同时对ISCOM疫苗的作用机理和其在免疫预防中的应用作了相应的概述.     

免疫刺激复合物的佐剂作用及其在兽用疫苗上的应用

本文介绍一种新型佐剂免疫刺激复合物(Iscoms)的组成,及其在抗原的摄取、细胞因子分泌、T细胞和B细胞反应等三个方面对免疫反应的调节。同时对Iscoms在兽用疫苗上的应用也作了相应的概述。     

新型免疫佐剂--免疫刺激复合物(ISCOM)的研究进展

免疫刺激复合物(immunostimulating complex,ISCOM)是由抗原物质与由皂树皮提取的一种糖苷QuilA及胆固醇按1：1：1混合后自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡。每个小泡直径40nm,约含10～12个分子的蛋白质。ISCOM是一种全新的抗原递呈系统,对机体有免疫增强作用,具有佐剂和抗原递呈的双重功能。应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗,具有产生“全面”免疫应答的效力,可长期增强特异性抗体应答。     

伪狂犬病病毒免疫刺激复合物(ISCOM)的制备及其免疫效果检测

制备了伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物(ISCOM).在电镜下呈典型笼状结构,直径约为40 nm.其中抗原成分经SDS-PAGE电泳只出现一条带.用所制备的ISCOM 10μg为一头份免疫兔,中和抗体的最高效价为1:45,ELISA抗体效价最高可达1:128,两者均高于相同头份的亚单位疫苗、灭活疫苗及弱毒疫苗.ISCOM免疫兔后,攻击100 LD50闽A株强毒,保护率为100%.     

免疫刺激复合物在鼻腔免疫中的研究进展

早已证明免疫刺激复合物在注射免疫中可起着有效的强佐剂和载体输送系统。不同抗原结合形成的ISCOM也已证明在粘膜免疫中有效。Lovgren等首次用低剂量的流感病毒ISCOM单次鼻腔接种后可诱导粘膜免疫应答而产生保护作用。进一步研究结果表明,ISCOM与霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热依赖性毒素(LT)一样,可打破免疫耐受,表现强粘膜佐剂活性,产生分泌性IgA和系统免疫应答,鼻腔接种ISCOM后最为显著的特点是能引起CTL反应。与CT相比,ISCOM先产生粘膜免疫随之产生系统免疫应答,此系统免疫应答依赖于IL-12,与IL-4无关。重组霍乱毒素与相同ISCOM粒子结合后起协同作用。鼻腔接种γCTB-ISCOM后,对γCTB的IgA应答在肺中增加100倍,在远距离的生殖道粘膜免疫中增加10倍多。在生殖道中也证实可加强对OVA抗原的IgA应答,接种RSV-衣壳蛋白-ISCOM后,产生高血清抗体,同样,注射免疫后,在局部呼吸粘膜和远处生殖道和肠道粘膜中均引起强烈的Ig A应答。Herpes simplex virus、流感病毒以及Mycoplasma mycoides等的衣壳蛋白与ISCOM结合后也出现相似结果。在应答过程中,利用了RSV衣壳蛋白可锚定粘膜的特性,鼻腔接种HIV-gp120RSV-ISCOM后在雌体生殖道中可观察到很强的分泌性IgA对gp120的免疫应答。总之,病毒衣壳蛋白、细胞膜蛋白等此类抗原与ISCOM结合后依然保持其生物学活性、形态结构、可锚定粘膜以及中和病毒等特性。ISCOM是一种多用途输送系统,被应用于粘膜免疫尤其适用于鼻腔免疫,它依赖于IL-12诱导粘膜免疫,而且ISCOM能诱导Th1/Th2的平衡性应答且无耐受。     

Quil A与PICKCa的免疫调节作用研究

为了探讨Quil A、PICKCa及二者联合使用对实验动物的免疫调节作用,试验分别给小鼠和猪注射Quil A、PICKCa及两者混合物,于注射后不同时间采血,检测细胞因子水平;注射后第7天检测猪T淋巴细胞的体外增殖反应。结果表明:小鼠和猪在注射药物之后均未出现任何不良反应;试验组动物的细胞因子水平均显著高于对照组;猪T淋巴细胞体外增殖能力也显著高于对照组。说明Quil A、PICKCa对小鼠和猪具有良好的免疫调节作用。     

猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物的制备

以非离子去污剂Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，与新型佐剂ISCOM基质作用，应用离心和透析相结合的方法制备了猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物（PRV－ISCOMs）。PRV－ISCOMs经磷钨酸负染后电镜观察见到囊膜蛋白分布在ISCOM颗粒表面，形成直径30－40nm的笼格状结构，同时将PRV－ISCOMs在－20℃冻融5次后经电镜观察仍见到典型的笼格状结构，与国外报道的形态一致，本结果证实我们成功地制备了具有良好稳定性的PRV－IS－COMs。     

复合免疫刺激物-大肠杆菌苗的研制及效力测定

采用对比试验方法,以小白鼠为实验动物,进行了复合免疫刺激-大肠杆菌苗的研制及效力测定。结果,试验组菌苗的保护率为84.62%,均高于对照组氢氧化铝胶苗组(53.85%,P<0.05)、蜂胶佐剂苗组(58.33%,P<0.05)、空白对照组(38.46%,P<0.01);试验组小白鼠的增重率为27.52%,均高于对照组氢氧化铝胶苗组(22.31%,P<0.01)、蜂胶佐剂苗组(23.98%,P<0.01)、空白对照组(17.22%,P<0.01);试验组的免疫器官指数为8.01%,高于空白对照组(7.67%,P<0.01)与铝胶苗组(7.96%,P>0.05)。表明该复合免疫刺激物-大肠杆菌苗的免疫效力较好,复合免疫刺激物具有较强的免疫增强力,是一种较好的免疫佐剂。     

绿脓杆菌外毒素A的纯化

用绿脓杆菌ＰＡ１０３株接种于ＴＳＡ甘油培养基３２℃培养，产生绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ），经流水透析除盐、ＤＥ－５２纤维素阶段洗脱、硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５除盐、ＤＥ－５２纤维素梯度洗脱、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００分子筛层析，纯化了绿脓杆菌外毒素Ａ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，纯化后的毒素为单一蛋白带，分子量约６６０００；对普通小鼠ＬＤ５０为０．２４μｇ蛋白。用ＰＥＡ抗血清作免疫印迹分析，进一步证实纯化的蛋白为ＰＥＡ，毒素约纯化了５００倍，总蛋白回收率约０．０２４％，毒素回收率约１１％。     

饲料中黄霉素A的测定

本试验建立了高效液相色谱法测定饲料中黄霉素A的方法。饲料中的黄霉素经提取,并用C18小柱净化后,对其进行高效液相色谱测定。此方法黄霉素定量限为2mg/kg,黄霉素A定量限为1.5mg/kg。黄霉素添加浓度为2、3、5mg/kg时,黄霉素A的回收率在88.5%～113.2%之间,变异系数在2.2%～5.1%之间。     

Saponin Adjuvants. IV. Evaluation of The Adjuvant Quil a in the Vaccination of Cattle Against Foot-And-Mouth Disease

The saponin adjuvant Quil A has been investigated in the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease. Using a Frenkel type vaccine a dose-response relationship has been established between Quil A and neutralizing antibody titres. Ten ml of vaccine was combined with 0, 50, 200, 800, and 3200 µg of Quil A. The combinations were each injected into 4 animals. The local reaction on the site of injection produced by injection of the vaccine alone and in combination with different doses of Quil A has been estimated. On this basis a therapeutical dose at 1 mg of Quil A has been estimated to combine maximum adjuvant effect with a minimum of adverse reactions. This dose has been tested in the vaccination of cattle with FMD vaccines derived from BHK suspension cell virus of type O and A respectively. The vaccines were tested in 10 ml and 5 ml doses with or without Quil A, and each in 4 animals. It is concluded that Quil A is a valuable adjuvant for use in the induction of neutralizing antibodies against foot-and-mouth disease in cattle.     

Saponin Adjuvants. Vi. The Adjuvant Activity of Quil a in Trivalent Vaccination of Cattle and Guinea Pigs Against Foot-And-Mouth Disease

The saponin adjuvant Quil A was investigated in trivalent vaccination against foot-and-mouth disease with a concentrated vaccine based on BHK suspension cell virus of the serotypes O, A and G. The activity in cattle was estimated on the basis of seroneutra-lizing antibodies. Five and 10 ml doses with or without 1 mg of Quil A were each injected into 6 animals. Seroneutralizing antibodies were estimated at regular intervals during a period of 29 weeks. The activity in guinea pigs was estimated by experimental challenge. One ml doses of serial 4-fold dilutions of the vaccine with or without 50 µg of Quil A were injected into 24 groups of 20 guinea pigs. Challenge was given 3 weeks after vaccination.It was concluded that Quil A showed adjuvant activity in cattle and guinea pigs with all the serotypes used in the trivalent vaccination.     

利用套式PCR检测牛羊乏质体

为同时检测和鉴定牛边缘乏质体、中央乏质体及绵羊乏质体,根据这3种病原体的msp4基因核苷酸序列,自行设计、合成了针对3种乏质体的2对通用引物,及分别针对三者的特异引物,通过PCR条件优化,建立了检测乏质体及分别鉴定3种乏质体的套式PCR方法,并与OIE推荐的msp5半套式PCR比较.结果显示:该方法对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、羊莫氏巴贝斯虫、山羊泰勒虫、温氏附红细胞体、东方巴贝斯虫、刚地弓形虫、伊氏锥虫均未扩增出特异性片段.套式PCR检测乏质体DNA量为0.2 pg(相当于6个感染红细胞).检测l 119份来自6个不同地区的奶牛、肉牛、水牛及羊的临床样品,阳性106份,经鉴定边缘乏质体46份,中央乏质体15份,绵羊乏质体35份,混合感染中央乏质体和绵羊乏质体4份,混合感染边缘乏质体和绵羊乏质体3份,混合感染边缘乏质体和中央乏质体3份.首次在分子生物学水平证明中央乏质体存在于中国.同时,证明牛可以混合感染边缘乏质体和中央乏质体或绵羊乏质体,以及混合感染中央乏质体和绵羊乏质体.上述848份样品用OIE推荐的msp5半套式PCR同时检测,两者符合率为98.5％(835/848).检测结果表明,msp4套式PCR特异、敏感,可用于边缘乏质体、中央乏质体、绵羊乏质体的检测和鉴定.     

甲型流感病毒NP蛋白原核表达及其金标检测方法的建立

构建甲型流感病毒NP基因重组质粒,制备NP蛋白,建立甲型流感病毒胶体金检测方法。设计引物,扩增人工合成的甲型流感病毒株A(H5 N1)(GenBank登录号AY585439)NP DNA基因,构建pET-30 Xa/LIC-NP重组质粒,转化入原核表达系统E.coliBL21 Gold中进行表达和纯化。结果制备了纯度高达900 mL/L的甲型流感病毒NP融合蛋白,并初步建立了金标检测方法。     

塞内卡病毒A的RT-PCR检测方法的建立和应用

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,可引起成年母猪水疱性病变,并导致新生仔猪死亡。为建立SVA的快速检测方法,本研究对NCBI发表的40株SVA的基因序列进行同源比较,选择保守区域设计了3对引物P1、P2和P3,从中筛选出最佳扩增引物,通过对引物浓度、退火温度、延长时间、循环次数进行优化,成功建立了SVA的RT-PCR检测方法。用该方法检测SVA、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应,具有良好的特异性。敏感性试验结果显示,病毒检测限可达1TCID50,比国外文献报道的检测方法灵敏性更高。用该方法检测山东省的100份猪组织样品,阳性率为2%。本研究所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,为SVA的快速检测及流行病学调查提供了有效的技术手段。     

“一针肥注射液”中微量元素含量测定方法的建立

目的：建立＂一针肥注射液＂中微量元素的含量测定方法。方法：采用火焰原子吸收分光光度法测定＂一针肥注射液＂中铁、锌、铜、硒、钴的含量。结果：铁、锌、铜、硒、钴的线性范围分别为0.053~0.385μg/mL、0.25~2.50μg/mL、0.5~8.0μg/mL、10.0~100.0ng/mL、5.0~50.0ng/mL,平均回收率分别为100.35%、99.95%、99.51%、98.49%、100.51%。结论：本法可以准确测定＂一针肥注射液＂中铁、锌、铜、硒、钴的含量,该法简便、快速、准确可靠。     

铁和维生素A对肉仔鸡肝脏、血清中A、E浓度的影响

研究日粮Fe(0 .30 ,6 0mg kg)和VA(75 0 ,15 0 0 ,2 70 0IU kg)水平对肉仔鸡不同生长阶段 (0～ 4周龄和 5～ 7周龄 )肝脏、血清中VA、VE浓度的影响。结果表明 :铁对前后期肝脏及血清的VA浓度影响均显著 (P <0 .0 5 ) ,随着铁添加水平的增加 ,肝VA浓度下降 ,血清VA浓度上升。铁对前后期肝脏及血清的VE浓度影响均极显著 (P <0 .0 1) ,随着铁添加水平的增加 ,肝VE浓度下降 ,血清VE浓度上升。VA对前后期肝脏及血清的VA浓度影响均显著 (P <0 .0 5 ) ,随着VA添加水平的增加 ,肝脏及血清的VA浓度上升。VA对前后期肝脏及血清的VE浓度影响均显著 (P <0 .0 5 ) ,随着VA添加水平的增加 ,肝VE浓度下降 ,血清VE浓度上升。     

A、J亚群禽白血病病毒感染肉用种鸡的诊断

通过流行病学调查、剖检病变和组织病理学观察,结合PCR技术检测病原核酸,确诊肉用种鸡群发生了由ALV—A和ALV—J感染而导致的淋巴细胞性白血病和骨髓细胞瘤型白血病。在检测的6只病鸡中,6只病鸡均感染了ALV—J,2只病鸡感染了ALV-A.     

Racing Induces Changes in the Blood Concentration of Serum Amyloid A in Thoroughbred Racehorses

Intensive exercise results in the increased blood concentration of the acute phase proteins in horses competing in some sport disciplines. In this study, the blood level of serum amyloid A (SAA) was analyzed in Thoroughbred racehorses during 5 days after completion of the race. Samples were collected from 25 healthy Thoroughbred horses beginning with 4 hours after the race and repeated daily up to the fifth day after the race. Serum amyloid A analysis was performed using commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit, and the results were presented as median, interquartile range (IQR), and range. Data were analyzed using Friedman's nonparametric analysis of variance. The acute phase response (APR) was reflected by an increased SAA level after the race, reaching significantly higher concentrations on days 1 (P < .001) and 2 (P = .005) and falling below the level of the first sample on day 5 (P = .006). The median peak concentration observed on day 1 after the race was 3.84 mg/L (IQR, 2.32 to 8.86). Racing induces minute changes in SAA concentration typical for the exercise-induced APR; however, the significance of this reaction in the context of horse health and fitness remains unclear.